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Title: Fármacos com ação dual anti-Trypanosoma cruzi e imunomoduladora: Uma nova abordagem para o tratamento da miocardiopatia chagásica crônica
Advisor: Soares, Milena Botelho Pereira
Members of the board: Reis, Mitermayer Galvão dos
Borges, Valéria de Matos
Teixeira, Marcia Cristina Aquino
Authors: Meira, Cássio Santana
Coadvisor: Moreira, Diogo Rodrigo Magalhães
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract: A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, que afeta milhões de pessoas na America Latina. No Brasil e em muitos países, o tratamento dessa enfermidade se baseia na utilização de benzonidazol. Este fármaco tem o seu uso associado a uma série de efeitos colaterais no paciente ao longo do tratamento e uma baixa taxa de cura nos indivíduos com doença crônica. Nesse contexto, é necessário o desenvolvimento de novos medicamentos para uma quimioterapia adequada da doença de Chagas crônica, sobretudo na forma cardíaca da doença. OBJETIVO: Este estudo teve como objetivo testar o derivado semissintético do ácido betulínico (BA5) e o esfingolipídio N,N-dimetil esfingosina (DMS), moléculas com propriedades antiparasitária e imunomoduladora, para o tratamento da cardiomiopatia chagásica crônica. MATERIAIS E MÉTODOS: O efeito tripanocida foi avaliado in vitro em tripomastigotas do T. cruzi e também na proliferação de formas amastigotas intracelulares em culturas de macrófagos peritoneais infectados com T. cruzi, com determinação de valores de concentração inibitória (CI)50. A atividade imunomoduladora in vitro foi avaliada em cultura de macrófagos estimulados com LPS + IFNγ e em esplenócitos estimulados com concanavalina A através da quantificação de mediadores inflamatórios por ELISA e em ensaios de linfoproliferação pela incorporação de 3H-timidina. A ação imunomoduladora do BA5 foi validada in vivo em modelo de endotoxemia e de reação de hipersensibilidade tardia (DTH). Por último, camundongos C57BL/6 cronicamente infectados com T. cruzi foram tratados com BA5 ou DMS, e submetidos a avaliações de função cardíaca, quantificação de inflamação e fibrose no coração, de citocinas no soro por ELISA, e análises de PCR para avaliar a modulação da expressão gênica no coração e a carga parasitária no baço. RESULTADOS: Assim como o BA5 (já previamente estudado), o DMS apresentou um efeito anti-T. cruzi direto, porém também age através da ativação da via do inflamassoma gerando a produção de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio. Quando testados em culturas de macrófagos e linfócitos ativados, os compostos mostraram uma potente atividade imunomoduladora, reduzindo a produção de mediadores inflamatórios e inibindo a proliferação de linfócitos. In vivo, o BA5 demonstrou potente atividade imunomoduladora, conferindo proteção contra dose letal de LPS e reduzindo edema em modelo de DTH. Observamos uma redução significativa da inflamação e fibrose nos corações dos animais chagásicos crônicos tratados com BA5 ou DMS, achados estes que foram acompanhados por uma redução dos níveis séricos de TNFα e IFNγ, assim como a redução da expressão gênica de mediadores inflamatórios no coração. Nos animais tratados com BA5 observamos também um aumento significativo na produção de IL-10 e na expressão gênica de arginase e CHI3, reconhecidos marcadores de macrófagos M2. A redução de mediadores inflamatórios poderia ocasionar um aumento na carga parasitária na CCC experimental. Entretanto, através da quantificação do DNA de T. cruzi no baço, demonstramos que o tratamento com o BA5 não alterou a carga parasitária, enquanto o tratamento com o DMS causou a redução da carga parasitária de forma substancial, evidenciado o efeito antiparasitário desta molécula. CONCLUSÃO: Nossos resultados demonstram que o BA5 e o DMS, através de ação antiparasitária e imunomoduladora, são candidatos em potencial para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da cardiomiopatia chagásica.
Abstract: Chagas disease is a zoonosis caused by the protozoan hemoflagellate Trypanosoma cruzi, which affects millions of people in Latin America. In Brazil and in many countries, the treatment of this disease is based on the use of benznidazole. Its use is associated with a number of side effects throughout the treatment and has a low cure rate in individuals with chronic disease. In this context, the development of new drugs for a proper chemotherapy of chronic Chagas' disease is necessary, especially in the cardiac form of the disease. OBJECITVE: This study aimed to test the semisynthetic derivative of betulinic acid (BA5) and sphingolipid N,N-dimethyl sphingosine (DMS), two molecules with antiparasitic and immunomodulatory properties, for the treatment of Chagas' heart disease. MATERIALS AND METHODS: The trypanocidal effect was evaluated in vitro in T. cruzi trypomastigotes and also in the proliferation of intracellular amastigote forms in cultures of peritoneal macrophages infected with T. cruzi, with determination of inhibitory concentration (IC)50 values. Immunomodulatory activity in vitro was evaluated in culture of macrophages stimulated with LPS + IFNγ and in splenocytes stimulated with concanavalin A by the quantification of inflammatory mediators by ELISA and in lymphoproliferation assays by the incorporation of 3H-thymidine. The immunomodulatory action of BA5 was validated in vivo in a model of endotoxemia and delayed hypersensitivity (DTH). Finally, C57BL/6 mice chronically infected with T. cruzi were treated with BA5 or DMS and subjected to evaluations of cardiac function, quantification of inflammation and fibrosis in the heart, serum cytokines by ELISA, and PCR analyzes to evaluate the modulation of gene expression in the heart and the parasite load on the spleen. RESULTS: Similar to BA5 (already previously studied), DMS presented a direct anti-T. cruzi effect, but also presented a potential to activate inflammasome pathway generating the production of nitric oxide and reactive oxygen species. When tested in macrophages and lymphocyte activated cultures, both compounds showed potent immunomodulatory activity, reducing the production of inflammatory mediators and inhibiting lymphocyte proliferation. In vivo, BA5 demonstrated potent immunomodulatory activity, conferring protection against lethal dose of LPS and reducing edema in the DTH model. We observed a significant reduction of inflammation and fibrosis in the hearts of chronic chagasic animals treated with BA5 or DMS, which were accompanied by a reduction in serum levels of TNFα and IFNγ, as well as the reduction of the gene expression of inflammatory mediators in the heart. In BA5-treated animals we also observed a significant increase in IL-10 production and in the gene expression of arginase and CHI3, recognized markers of M2 macrophages. The reduction of inflammatory mediators could cause an increase in the parasitic load in the experimental CCC. However, through the quantification of T. cruzi DNA in the spleen, we demonstrated that the treatment with BA5 did not alter the parasitic load, whereas the treatment with DMS caused the reduction of the parasite load substantially, evidencing the antiparasitic effect of this molecule. CONCLUSION: Our results demonstrate that BA5 and DMS, through antiparasitic and immunomodulatory action, are potential candidates for the development of new drugs for the treatment of chagasic cardiomyopathy.
Keywords: Chagas disease
T. cruzi
N,N-dimethylsphingosine
Betulinic acid
Chagasic cardiomyopathy
keywords: Doença de Chagas
T. cruzi
N,N-dimetil esfingosina
Ácido betulínico,
Cardiomiopatia chagásica
Issue Date: 2018
Publisher: Instituto Gonçalo Moniz
Citation: MEIRA, C. S. Fármacos com ação dual anti-Trypanosoma cruzi e imunomoduladora: Uma nova abordagem para o tratamento da miocardiopatia chagásica crônica. 2018. 236 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa) – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, 2018.
Date of defense: 2018-03-22
Place of defense: Salvador/Ba
Department: Coordenação de Ensino
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz
Program: Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
Copyright: open access
Appears in Collections:BA - IGM - Teses de Doutorado

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