Please use this identifier to cite or link to this item: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/29295
Title: Otimização, Padronização, Validação e Avaliação Comparativa de Testes de Quantificação dos Anticorpos Neutralizantes para o Vírus da Febre Amarela
Advisor: Camacho, Luiz Antonio Bastos
Lima, Sheila Maria Barbosa de
Authors: Simões, Marisol
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A febre amarela (FA) é uma doença infecciosa aguda, febril, causada pelo vírus protótipo do gênero Flavivirus. A doença permanece como grande problema de saúde pública, principalmente em regiões endêmicas da África e América do Sul. No Brasil, ondas alarmantes de epizootias e epidemias são registradas desde 2016. A vacinação é a maneira mais eficaz de prevenção e controle da FA. As vacinas disponíveis produzidas com as subcepas 17D-204 e 17DD são seguras e imunogênicas, induzindo a formação de anticorpos neutralizantes que aparecem precocemente, são protetores e de longa duração. Apesar de ser considerado referência para a análise da resposta imune protetora após a vacinação, a metodologia clássica do teste de neutralização por redução de placas de lise (PRNT) é trabalhoso, de difícil execução, requer recursos humanos, equipamentos e insumos específicos, além de um tempo longo para a sua finalização, mesmo na versão micro PRNT (em placas de 96 poços). Esta adaptação do método é mais operacional do que o PRNT (em placas de 6 poços), com maior capacidade de processamento das amostras. Mas, além das desvantagens semelhantes ao teste referência, apresenta a dificuldade de leitura das placas de lise por ser realizado em poços menores. A busca por um teste mais rápido, semiautomatizado e eficiente para a quantificação de anticorpos neutralizantes vem ao encontro das necessidades de aumento da capacidade e melhoria de análises das amostras de estudos clínicos O presente estudo objetivou não somente otimizar a metodologia já utilizada na rotina do Laboratório de Tecnologia Virológica para os estudos de avaliação de imunogenicidade das vacinas para FA (micro PRNT), mas também padronizar uma metodologia mais rápida e semiautomatizada denominada \03BCPRN-HRP. A partir da definição dos protocolos de execução, ambas as metodologias foram validadas com os parâmetros de precisão, exatidão, seletividade e robustez. Posteriormente à validação, 200 soros de indivíduos vacinados foram processados pelas três metodologias para a avaliação da concordância (Coeficiente de Correlação Intraclasse, CCI) dos testes índices (micro PRNT e \03BCPRN-HRP) com o teste referência (PRNT). Os critérios de análise predefinidos para todos os ensaios de validação foram alcançados pelas metodologias em placas de 96 poços. O micro PRNT apresentou concordância moderada a substancial com o PRNT tanto para os títulos em log10 da recíproca da diluição (CCI de 0,59 e 0,74) quanto para os títulos em log10 de mUI/mL (CCI de 0,48 e 0,65). O \03BCPRN-HRP apresentou concordância de fraca a moderada com o PRNT para os títulos em log10 da recíproca da diluição (CCI de 0,29 e 0,45). Mas, para os títulos em log10 mUI/mL, os estimadores de concordância apresentaram magnitude substancial a quase completa com o PRNT (CCI de 0,69 e 0,82). Os coeficientes de correlação linear obtidos para os testes índices foram muito próximos, sugerindo correlação moderada (r > 0,70) com o teste referência para os títulos em recíproca da diluição e em mUI/mL. Portanto, tanto o micro PRNT quanto o \03BCPRN-HRP podem ser utilizados na avaliação das vacinas para FA, gerando resultados confiáveis. O \03BCPRN-HRP destaca-se por ser um teste mais rápido, semiautomatizado e com maior capacidade de processamento de amostras.
Abstract: Yellow fever (YF) is an acute, febrile infectious disease caused by the prototype virus of the genus Flavivirus. The disease remains a major public health problem, especially in endemic areas in Africa and South America. In Brazil, alarming waves of epizootics and epidemics have been reported since 2016. Vaccination is the most effective way to prevent and control YF. The available vaccines produced with 17D-204 and 17DD substrains are safe and immunogenic, inducing the formation of neutralizing antibodies that appear early, are protective and long lasting. Although it is considered a reference for the analysis of the protective immune response after vaccination, the classical methodology of the plaque reduction neutralization test (PRNT) is labor intensive, difficult to execute, requires specific human resources, equipment and inputs, besides a long time for its finalization, even in the micro PRNT version (in 96-well plates). This adaptation of the method is more operational than the PRNT (in 6-well plates), with higher sample throughput. But, in addition to the disadvantages similar to the reference test, it presents the difficulty of reading plaques by being run in smaller wells. The search for a faster, semi-automated and efficient test for the quantification of neutralizing antibodies meets the needs of increasing throughput and improving analyzes of clinical trial samples The present study aimed not only to optimize the methodology already used in the routine of the Virological Technology Laboratory in the immunogenicity evaluation studies of the vaccines for YF (micro PRNT), but also to standardize a faster and semi-automated methodology called \03BCPRN-HRP. From the definition of the execution protocols, both methodologies were validated with the parameters of precision, accuracy, selectivity and robustness. After the validation, 200 sera of vaccinees were processed by the three methodologies for the evaluation of the agreement (Intraclass Correlation Coefficient, ICC) of the index tests (micro PRNT and \03BCPRN-HRP) with the reference test (PRNT). The predefined analysis criteria for all validation assays were achieved by methodologies in 96-well plates. The micro PRNT showed moderate to substantial agreement with the PRNT for both log10 titers of the reciprocal dilution (ICC of 0.59 and 0.74) and log10 mIU/mL titers (ICC of 0.48 and 0.65). The \03BCPRNHRP showed weak to moderate agreement with the PRNT for log10 titers of reciprocal dilution (ICC of 0.29 and 0.45). However, for log10 mIU/mL titers, the agreement estimators showed a substantial to almost complete magnitude with PRNT (ICC of 0.69 and 0.82). The linear correlation coefficients obtained for the index tests were very close, suggesting a moderate correlation (r> 0.70) with the reference test for titers in reciprocal dilution and in mIU/mL. Thus, both micro PRNT and \03BCPRN-HRP can be used to evaluate vaccines for YF, generating reliable results. The \03BCPRN-HRP stands out as being a faster, semi-automated and with a higher sample throughput.
keywords: Febre Amarela
Testes de Neutralização
Anticorpos Neutralizantes
Estudos de Validação
Issue Date: 2018
Citation: SIMÕES, Marisol. Otimização, Padronização, Validação e Avaliação Comparativa de Testes de Quantificação dos Anticorpos Neutralizantes para o Vírus da Febre Amarela. 2018. 183 f. Tese (Doutorado em Medicina Tropical)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro
Department: Instituto Oswaldo Cruz
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGMT - Teses de Doutorado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
marisol_simoes_ioc_dout_2018.pdf32.01 MBAdobe PDFView/Open


FacebookTwitterDeliciousLinkedInGoogle BookmarksBibTex Format mendeley Endnote DiggMySpace

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.