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Title: Expressão da proteína de envelope do vírus zika em sistema eucarioto e procarioto para a seleção de anticorpos monoclonais
Advisor: Medeiros, Marco Alberto
Members of the board: Almeida, Vinicius Cotta de
Santos, Flávia Barreto dos
Freire, Marcos da Silva
Peralta, José Mauro
Pinto, Marcelo Alves
Authors: Chaves, Thiago Santos
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: O Zika vírus (ZIKV) é uma arbovírus pertencente a família flaviviridae e ao gênero flavivírus transmitido principalmente pelo mosquito Aedes Aegypti. Recentemente, o Brasil passou por um período de emergência em saúde pública causada pelo ZIKV quando o mesmo foi associado a complicações neurológicas em neonatos. Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos, testes rápidos confiáveis para o diagnóstico da doença ainda são escassos. Além disso, possíveis tratamentos como o desenvolvimento de vacinas terapêuticas, ainda não foram alcançados. Sendo assim, esforços para a obtenção de insumos e avaliação dos mesmos como possíveis candidatos ao desenvolvimento de testes rápidos ou para uma imunoterapia se fazem necessários. O objetivo deste trabalho foi realizar a expressão da proteína de envelope do ZIKV utilizando os sistemas de expressão Escherichia coli e células de inseto/baculovírus a fim de avaliar a viabilidade da utilização destas proteínas na seleção e caracterização de anticorpos monoclonais específicos contra ZIKV. A proteínas foi expressa de forma insolúvel em ambos os sistemas com níveis mais elevados de recuperação após purificação da proteína expressa em células de E. coli As proteínas recombinantes obtidas em ambos os sistemas foram reconhecidas pelo anticorpo monoclonal 4G2 específico para flavivírus em ensaios de antigenicidade e também pelos soros de pacientes infectados por ZIKV. Nós observamos também reatividade cruzada com soro de paciente infectado por Dengue vírus (DENV) que ocorreu de forma mais discreta contra a proteína expressa em sistema células de inseto/baculovírus. Camundongos BALB/c foram submetidos a esquema de imunização com ZIKV para obtenção de anticorpos monoclonais. O anticorpo gerado foi capaz de reconhecer, em ensaios imunoenzimáticos, tanto as proteínas de envelope expressas nos sistemas procarioto e eucarioto quanto o vírus, o que indica que as ambas proteínas são aptas para a seleção de anticorpos monoclonais. Após a identificação dos CDRs do anticorpo monoclonal gerado, análises in silico demonstraram que este anticorpo tem afinidade por uma região do domínio III (DIII) da proteína de envelope do ZIKV que é o principal alvo de anticorpos neutralizantes. Estas análises também demonstraram uma possível especificidade deste anticorpo, já que não foi possível observar reconhecimento com a proteína envelope homóologa de DENV. Os resultados aqui apresentados sugerem não haver diferença entre as proteínas recombinantes estudadas quando utilizadas para a seleção de anticorpos monoclonais. O anticorpo gerado neste trabalho parece ser promissor e novos ensaios serão realizados a fim de avaliar a viabilidade para a sua utilização como insumo no manejo de infecções por ZIKV.
Abstract: The Zika virus (ZIKV) is an arbovirus belonging to the family flaviviridae and to the genus flavivirus transmitted mainly by the mosquito Aedes Aegypti. Recently, Brazil went through a period of public health emergency caused by ZIKV when it was associated with neurolopgical complications in neonates. Despite the advances made in recent years, reliable rapid tests for the diagnosis of the disease are still scarce and possible treatments, like the development of therapeutic vacines, are not avaible yet. Therefore, efforts to obtain suplies and evaluate them as possible candidates for the development of rapid tests or for immunotherapy are necessary. The aim of this work was to perform ZIKV envelope protein expression using the Escherichia coli and insect cell/baculovírus systems to evaluate the feasibility of the use of the protein in the selection and characterization of specific monoclonal antibodies against ZIKV. The protein was expressed in an insoluble form in both systems with higher levels of recovery after purification from E. coli Recombinant proteins were recognized by the monoclonal antibody specific 4G2 for flavivirus in antigenicity assays and also by sera from ZIKV infected patients exhibiting cross-reactivity with the serum of a DENV-infected patient more discreetly in the protein expressed in insect cell/baculovírus system. BALB/c mice underwent immunization with ZIKV to obtain monoclonal antibodies. The generated antibody was able to recognize in immunoenzymatic assays both the envelope proteins expressed in the prokaryotic and eukaryotic systems as well as the vírus, which indicates that both recombinant proteins are suitable for the selection of monoclonal antibodies. After identification of the CDRs of the generated monoclonal antibody, in silico analyzes demonstrated that this antibody has affinity for a region at domain III (DIII) of the ZIKV envelope protein, this domain is the main target of neutralizing antibodies in this protein in flaviviruses. These analyzes also demonstrated a possible specificity of this antibody since recognition with the homologous DENV envelope protein could not be observed. The results presented here suggest that there is no difference between the recombinant proteins studied when used for the selection of monoclonal antibodies. The antibody generated in this work seems to be promising and new tests will be carried out in order to evaluate the feasibility for its the use supplies as a tool in the management of ZIKV infetions.
keywords: Zika virus
Anticorpos Monoclonais
Infecções por Arbovirus
Perfilação da Expressão Gênica
Issue Date: 2018
Citation: CHAVES, Thiago Santos. Expressão da proteína de envelope do vírus zika em sistema eucarioto e procarioto para a seleção de anticorpos monoclonais. 2018. 138 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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