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Title: Obtenção de uma nova proteína quimérica para o uso em teste de diagnóstico sorológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi
Advisor: Junqueira, Angela Cristina Verissimo
Provance Junior, David William
Members of the board: Guimarães, Ana Carolina Ramos
Silva, Silvia Amaral Gonçalves da
Atella, Giorgia
Dutra, Patricia Maria Lourenço
Monteiro, Robson de Queiroz
Authors: Durans, Andressa da Matta
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Doença de Chagas é uma doença negligenciada que ainda carece de um diagnóstico de alta eficácia, capaz de ser realizado em curto espaço de tempo, fácil manuseio e de baixo custo, para as regiões endêmicas. O desempenho dos testes sorológicos varia de acordo com a atividade e a qualidade da preparação de antígenos utilizados para a detecção de anticorpos anti-T. cruzi. Neste estudo foi apresentado uma abordagem inovadora em forma de uma proteína quimérica carreando epítopos de várias proteínas de T. cruzi que sirva de alvo em testes sorológicos, denominada de Plataforma Cruzi (PlatCruzi). Os epítopos B lineares inseridos na poliproteína foram selecionados de um conjunto de estruturas previamente identificadas experimentalmente, tanto em nosso laboratório quanto da literatura. A proteína quimérica foi construída contendo um cerne estrutural que permite a inserção de dez epítopos. Um gene foi gerado sinteticamente com oito epítopos inseridos, os outros dois epítopos foram inseridos por pareamento de oligonucleotídeos. O DNA sintetizado foi transferido para um vetor de expressão (pET-28a). A proteína quimérica resultante foi expressa em E. coli a elevados níveis em corpos de inclusão e purificadas até próximo da homogeneidade PlatCruzi mostrou alta reatividade contra soros de pacientes com doença de Chagas crônica (DChc) utilizados nas análises e sem reatividade na proteína sem inserção de epítopos. Os soros usados de pacientes infectados por Leishmania spp. não foram reativos com a PlatCruzi. Análises do desempenho individual dos epítopos de T. cruzi, inseridos na primeira plataforma, indicaram quatro epítopos que não apresentaram a reatividade esperada ao pool de soros de DChc, além disso, foi necessária modificação da posição de um epítopo, para o melhor reconhecimento do anticorpo IgG anti-T. cruzi. Esses resultados levaram a geração da variante PlatCruzi \03945, retirada do epítopo CRA (TcEp9) através do uso de enzimas de restrição, como também a criação da segunda versão da proteína quimérica, denominada de PlatCruzi V2, com mudanças estruturais e substituições de alguns epitpopos. Tanto a variante PlatCruzi \03945 quanto os resultados iniciais de PlatCruzi V2 não tiveram um melhor desempenho daquele apresentado por PlatCruzi, apontando a primeira versão da proteína quimérica com 100% de sensibilidade e especificidade nos ensaios imunoenzimáticos de ELISA. Em suma, os resultados sugerem que a engenharia da proteína quimérica poderá representar T. cruzi com sucesso em formatos de testes de diagnóstico rápidos e de ELISA que devem proporcionar uma elevada sensibilidade e especificidade para detectar indivíduos realmente infectados por T. cruzi
Abstract: Chagas disease is a neglected disease and there is still a need for diagnostics with a high efficacy, in a space of time, easy to handle and low cost, for the endigonous regions. The performance of serological tests varies according to the activity and quality of the antigen preparation for the detection of anti-T. cruzi antibodies. An innovative approach is presented in the form of a chimeric protein carrying epitopes of several T. cruzi proteins and serving as a target in serological tests, called the Platform with Cruzi (PlatCruzi). The linear B epitopes inserted into the polyprotein were selected from a set of structures previously identified experimentally, both in our laboratory and in the literature. The chimeric protein was constructed in conjunction with a nuclear structure that allows for the insertion of ten epitopes. One gene was generated synthetically with eight inserted epitopes, the other two epitopes were inserted by oligonucleotide pairing. The synthesized DNA was transferred to an expression vector (pET-28a). The resulting chimeric protein was expressed in E. coli at high levels in inclusion bodies and purified to near homogeneity PlatCruzi showed high reactivity against sera from patients with chronic Chagas' disease (DChc), used in the analyses of performance, which showed no reactivity against the protein nucleous without insertion of epitopes (control platform). Sera from individuals with Leishmania spp. was not reactive to PlatCruzi. Analysis of the individual performance of the T. cruzi epitopes, inserted in the first platform, indicated four epitopes that did not present the expected reactivity to the pool of DChc sera. In addition, it was observed that the insertion of epitopes at some positions influenced its recognition by anti-T. cruzi IgG antibodies. These results led to the generation of the PlatCruzi \03945 variant, which removed the CRA epitope (TcEp9) using restriction enzymes. In addition, a second version of the chimeric protein, named PlatCruzi V2, was designed for structural changes and substitutions of some epitopes. Both the PlatCruzi \03945 variant and the initial PlatCruzi V2 results did not perform better than the original PlatCruzi, pointing to a first version of the chimeric protein with 100% sensitivity and specificity in ELISA enzyme-linked immunosorbent assays. In summary, the results suggest that a chimeric protein was successfully engineered to represent T. cruzi for use in rapid diagnostic tests and ELISAs, that delivers elevated sensitivity and specificity to detect person truly infected by T. cruzi
keywords: Doença de Chagas
Testes Sorológicos
Proteínas Quinases
DeCS: Proteínas Mutantes Quiméricas
Issue Date: 2018
Citation: DURANS, Andressa da Matta. Obtenção de uma nova proteína quimérica para o uso em teste de diagnóstico sorológico da infecção pelo Trypanosoma cruziAndressa da Matta Durans. 2018. 165f. Tese (Doutorado em medicina tropical)-Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Medicina Tropical
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGMT - Teses de Doutorado

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