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Title: Aplicação da técnica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste
Other Titles: Application of the technique Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in developing a test for the plague diagnosis
Advisor: Leal, Nilma Cintra
Members of the board: Leal, Nilma Cintra
Schindler, Haiana Charifker
Lorena, Virginia Maria Barros de
Medeiros, Zulma Maria de
Marques, Carina Lucena Mendes
Authors: Nunes, Mariana de Lira
Coadvisor: Almeida, Alzira Maria Paiva de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract: A peste, infecção causada pela bactéria Yersinia pestis, é uma zoonose primária de roedores, geralmente transmitida por pulgas, que infecta humanos e outros mamíferos. O diagnóstico bacteriológico tradicional da peste pode ser comprometido pela qualidade das amostras coletadas em áreas remotas, transportadas inadequadamente e recebidas no laboratório semanas após a coleta. Técnicas de diagnóstico molecular dispensam o cultivo e são exequíveis quando as bactérias estão inviáveis ou em amostras multicontaminadas. Métodos moleculares convencionais (PCR, qPCR, Nested-PCR) requerem equipamentos sofisticados para amplificação e visualização dos resultados, impedindo seu uso em laboratórios menos equipados. A amplificação isotérmica mediada por loop (Loop-mediated isothermal amplification - LAMP), uma variação da PCR convencional, utiliza enzima que permite amplificação isotérmica, apresenta alta especificidade, sensibilidade, rapidez e custo reduzido, sendo utilizada na detecção de diversos patógenos. Esta técnica emprega de quatro a seis primers e a enzima Bst DNA polimerase, que além da atividade de síntese, atua abrindo a fita dupla de DNA. O resultado da amplificação é visualizado no próprio tubo, a olho nu. O objetivo deste projeto foi aplicar a técnica LAMP no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste. Foram construídos cinco primers específicos para amplificação do gene caf1, exclusivo de Y. pestis, utilizados em ensaios com o DNA da cepa Y. pestis A1122, para determinar as concentrações ótimas dos reagentes, temperatura de incubação (60°C, 63°C e 65°C) e tempo de duração da reação (15, 30, 45, 60 e 90 minutos). As reações foram incubadas em banho maria. A amplificação foi visualizada diretamente nos tubos contendo SYBR® Safe ou SYBR® Green I. Foi observado que a partir de 45 minutos de reação ocorre amplificação do gene caf1, nas três temperaturas testadas. Além disso, a técnica mostrou-se específica e sensível, detectando até 10 pg de DNA de Y. pestis.
Abstract: Plague, Yersinia pestis infection, is a primary rodent disease, usually transmitted by fleas, which infects humans and other mammals. The bacteriological diagnosis of plague may be hampered by the quality of the samples collected in remote areas, improperly transported and arrived at the diagnosis laboratories, weeks after collection. Molecular diagnostic techniques exempt culturing and are feasible in multicontaminated samples or if bacteria no longer lives. Most of the molecular methods (PCR, qPCR, Nested PCR) uses sophisticated equipment for amplification and results observation, precluding its use in less equipped laboratories. Loopmediated isothermal amplification (LAMP), a variation of conventional PCR, uses an enzyme for isothermal amplification, with high specificity, sensitivity, rapidity and low cost, and has been used for different pathogens detection. This technique employs four to six primers and Bst DNA polymerase enzyme and the amplification result is naked eye seen on the reaction tube. The objective of this work was to develop a LAMP-based procedure for plague diagnosis. Five specific primers were designed to amplify the caf1 gene, specific of Y. pestis and were used in assays with DNA from Y. pestis strain A1122 to determine the optimal concentrations of reagents, temperature (60°C, 63°C and 65°C) and reaction time (15, 30, 45, 60 and 90 minutes). The reactions were performed in a water bath and the amplifications were seen directly in the tubes containing SYBR ® Safe or SYBR® Green I. Detectable amplification of the caf1 gene was attained after 45 minutes at the three temperatures tested and the technique proved specific and sensitive, being able to detect up to 10 pg of DNA.
Keywords: Plague
Diagnosis
Yersinia pestis
Nucleic acid amplification method
Evaluation
keywords: Peste
Diagnóstico
Yersinia pestis
Técnicas de Amplificação Ácido Nucléico
Avaliação
DeCS: Peste/diagnóstico
Yersinia pestis/isolamento & purificaçäo
Técnicas de Amplificação de Ácido Nucleico/métodos
Reação em Cadeia da Polimerase
Avaliação
Sensibilidade e Especificidade
Primers do DNA
Issue Date: 2013
Citation: NUNES, Mariana de Lira. Aplicação da técnica Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) no desenvolvimento de um teste para o diagnóstico da peste. 2013. 74f. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde Pública) - Departamento de Saúde Coletiva, Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2013.
Date of defense: 2013-03-20
Place of defense: Recife/PE
Department: Departamento de Saúde Coletiva
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães.
Program: Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública
Copyright: open access
Appears in Collections:PE - IAM - PPBBS - Dissertações de Mestrado

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