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Title: Identificação de uma possível histona-linker em Toxoplasma gondii
Advisor: Nardelli, Sheila Cristina
Authors: Severo, Vanessa Rossini
Coadvisor: Ávila, Andréa Rodrigues
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A estrutura da cromatina é uma barreira que limita o acesso ao DNA pelos complexos proteicos. A alternância do nível de compactação da cromatina é regulada principalmente pelas histonas e suas modificações pós traducionais (MPTs). Toxoplasma gondii (T. gondii) possui as quatro histonas canônicas (H2A, H2B, H3 e H4), mas até o momento a quinta histona, H1 (ou histona-linker) não foi identificada. Em outros eucariotos, a histona H1 é parte fundamental na compactação da cromatina e sua ausência poderia levar a um estado menos compactado da cromatina em T. gondii. Identificamos uma possível histona H1, similar a H1-like de Kinetoplastidae, e que corresponde apenas à porção C-terminal de uma histona H1 típica, a qual denominamos TgH1-like. Através de análise estrutural in silico, verificamos que a proteína apresenta características comuns a histonas como um potencial eletrostático bastante positivo, devido à abundância em lisinas e argininas nessas proteínas. Para predição da função de TgH1-like, utilizamos o servidor ProFunc, onde obtivemos correspondência com modelo de histona h1b, sugerindo que TgH1-like poderia ter função de histona em Toxoplasma. Para caracterizar TgH1-like, realizamos o etiquetamento do epitopo do gene endógeno. Através de ensaio de imunofluorescência, foi possível verificar que a TgH1-like está localizado exclusivamente no núcleo do parasita. No entanto, por ensaios de western blot, TgH1-like-HA migrou como uma proteína de ~20 kDa, ao invés dos 9 kDa esperados para sua massa presvista. As histonas H1, assim como as demais histonas, são alvo de diversas MPTs, como metilação, acetilação, fosforilação e ubiquitinação. Recentemente foram identificados diversos sítios de ubiquitinação em proteínas de Toxoplasma, incluindo TgH1-like, o que corresponderia a um aumento de tamanho compatível com o encontrado. Para verificar se TgH1-like está associada a cromatina de T. gondii, realizamos um protocolo de extração de histonas por fracionamento celular, onde confirmamos a sua localização nuclear, e observamos uma parcela associada ao DNA juntamente com outras histonas, como a H4. Essa interação foi confirmada por ensaio de coimunoprecipitação, mostrando que a histona H4 precipita juntamente com a TgH1-like. Em busca de dados funcionais, realizamos o nocaute de tgh1-like, que não mostrou-se essencial a sobrevivência do parasita. Ensaios preliminares com parasitas DTgH1-like, através de ensaio de placa, resultou em um número de placas de lise maior quando comparado a parasitas controles, indicando que a replicação celular está alterada nesses parasitas. Corroborando esses dados, ensaios de imunofluorescencia indicaram um número maior de parasitas por vacúolo. Juntos, nossos dados indicam que TgH1-like está associada ao DNA e forma um complexo com outras histonas. Além disso, parasitas nocautes apresentaram alteração no ciclo celular do parasita, embora mais evidências sejam necessárias para corroborar tal alteração. Mostramos que TgH1-like apresenta características de histonas, não é essencial ao parasita, e outras análises funcionais estão em andamento para confirmarmos seu papel em T. gondii.
Abstract: Chromatin structure is a barrier limiting the access to DNA by protein complexes. The alternation of chromatin compaction level is mainly regulated by histones and their posttranslational modifications (PTMs). Toxoplasma gondii (T. gondii) has all four canonical histones (H2A, H2B, H3 and H4), but to date, the fifth histone H1 (or linker histone) has not been identified. In other eukaryotes, histone H1 is a fundamental part of chromatin compaction and its absence in T. gondii could result in a less compacted state of the chromatin. Here, we identified a possible histone H1, similar to the H1-like of Kinetoplastidae, which corresponds only to the Cterminal portion of a typical histone H1, named TgH1-like. Using in silico analysis, we verified that the protein shows common characteristics to histones, such as positive electrostatic potential, due to the abundance of lysines and arginines in these proteins. In order to imply TgH1-like function, we used the ProFunc serve, which obtained correspondence with histone h1b model, suggesting that TgH1-like could have histone function in Toxoplasma. To characterize TgH1-like, we performed the epitope tagging of the endogenous gene. By immunofluorescence analysis, it was possible to verify that TgH1-like-HA is located exclusively in the nucleus of the parasite. However, by Western blot assays, TgH1-like-HA migrated as a ~20 kDa protein, rather than the expected 9 kDa for its predicted mass. Histones H1, as well as other histones, are targets for several PTMs, such as methylation, acetylation, phosphorylation and ubiquitination. Recently, several ubiquitination sites on Toxoplasma were identified, including TgH1-like, which would correspond to the observed increase in size. To verify if TgH1-like is associated with T. gondii chromatin, we performed a histone extraction protocol by cell fractionation, confirming its nuclear localization, and we also observed a portion associated with DNA and other histones, such as H4. This interaction was confirmed by coimmunoprecipitation assay, showing that histone H4 co-immunoprecipitates with TgH1-like. In search of functional data, we performed the knock-out of tgh1-like, which did not show to be essential to survival of the parasite. Preliminary assays with ∆TgH1-like parasites, through plaque assay, resulted in a greater number of plaques lysis when compared to control parasites, indicating that cell replication is altered in these parasites. Corroborating these data, immunofluorescence assays indicated a larger number of parasites per vacuole. Together, our data indicate that TgH1-like is associated with DNA and forms a complex with other histones. In addition, tgh1-like knockout parasites present alterations in the parasite's cell cycle, although more evidence is needed to corroborate such alteration. We thus show that TgH1-like presents histone characteristics, is not essential for parasite survival, and further functional analysis are underway to define its role in T. gondii.
Keywords: Parasitology
Chromatin
Histones
Toxoplasma gondii
keywords: Toxoplasma gondii
Cromatina
Histona
DeCS: Parasitologia
Histonas
Issue Date: 2018
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: SEVERO, Vanessa Rossini. Identificação de uma possível histona-linker em Toxoplasma gondii. 2018. 73 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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