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Title: Avaliação histológica e de biocompatibilidade do pericárdio bovino após processo de descelularização branda para uso em biopróteses valvares
Advisor: Stimamiglio, Marco Augusto
Authors: Heuschkel, Marina Augusto
Coadvisor: Dominguez, Alejandro Correa
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: Valvulopatias são doenças que afetam a funcionalidade das válvulas cardíacas e o tratamento cirúrgico é realizado por meio da utilização de substitutos valvares. Dentre estes, as biopróteses convencionais apresentam limitações relacionadas a ruptura e a calcificação. Nesse contexto, visando o desenvolvimento de biopróteses valvares que superem estas limitações, o estudo busca avaliar a integridade estrutural e a biocompatibilidade do pericárdio bovino (PB) após processo de descelularização branda com solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,1%. A eficácia da descelularização dos PBs foi avaliada por meio da extração do DNA genômico seguido por quantificação e eletroforese em gel de agarose, coloração de Hematoxilina/Eosina (H&E) e marcação nuclear com 4’,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Ensaios de imunofluorescência foram realizados para a visualização das proteínas da matriz extracelular (MEC) e do xenoantígeno imunogênico galactose-alfa-1,3-galactose (alfa-gal). A biocompatibilidade do tecido foi avaliada através do seu cultivo com células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (aCTMs) humano. Assim, o processo de descelularização tecidual promoveu redução média de 77% da quantidade de DNA das amostras. Núcleos celulares não foram visíveis nas colorações de H&E e DAPI, apesar da presença de bandas de DNA maiores que 200 pb no gel de agarose. O conteúdo e a disposição dos colágenos I, III, IV, decorina e elastina não foram alterados com a descelularização. Porém, laminina e lumicam apresentaram marcação reduzida no tecido descelularizado, assim como a proteína de citoesqueleto vimentina. Foi observado por microscopia eletrônica de varredura um afrouxamento das fibras da face fibrosa do tecido descelularizado em comparação ao tecido fresco. Além disso, os PBs descelularizados apresentaram-se negativos para o antígeno alfa-gal e não-citotóxicos in vitro. Por fim, a análise de biocompatibilidade demonstrou a aderência das aCTMs ao tecido descelularizado após 24 h em cultivo e um arcabouço tecidual repopulado após 7 dias em cultura. Em conjunto estas características indicam que a descelularização branda do PB com solução de SDS 0,1% permite a obtenção de um arcabouço tecidual adequado para o repovoamento celular e para o desenvolvimento de biopróteses valvares.
Abstract: Valvulopathies are diseases that affect the functionality of the heart valves and the surgical treatment is performed through the use of valvar substitutes. Among these, conventional bioprosthesis present limitations related to its rupture and calcification. In this context, aiming the development of a valvular bioprostheses that overcome these limitations, the porpuse of this study is to evaluate the structural integrity and biocompatibility of the bovine pericardium (BP) after a soft decellularization process with a sodium dodecyl sulfate solution (SDS) 0.1%. The efficacy of BP decellularization was accessed by extracting genomic DNA followed by agarose gel electrophoresis, Hematoxylin/Eosin staining (H&E) and nuclear labeling with 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI). Immunofluorescence was performed in order to visualize the proteins of the extracellular matrix (ECM) and the immunogenic xenoantigen galactose-alpha-1,3-galactose (alpha-gal), found on the membrane of mammalian cells except humans and higher primates. The biocompatibility of the tissue was evaluated by its culture with Mesenchymal Stem Cells derived from human adipose tissue (MSC). Thus, decellularization process promoted a mean reduction of 77% of the amount of DNA in the samples. Cell nuclei were not visible in H&E and DAPI staining, despite the presence of DNA bands larger than 200 bp in the agarose gel. The content and arrangement of collagens I, III, IV, decorin and elastin were not altered with the decellularization. However, laminin and lumicam exhibited reduced tissue labeling after decellularization, as well as the cytoskeleton protein vimentin. Scanning electron microscopy showed a loosening of the fibers on the fibrous face of the decellularized tissue compared to the fresh one. In addition, the decellularized BPs were negative for the alpha-gal antigen and non-cytotoxic in vitro. Finally, the biocompatibility analysis demonstrated an adhesion of the MSCs to the decellularized tissue after 24 h in culture and a tissue scaffold repopulated after 7 days. Together, these characteristics indicate that the soft BP decellularization with SDS 0,1% solution allows the acquirement of a suitable scaffold for cell repopulation and for the development of valvular bioprostheses.
Keywords: Heart Diseases
Decellularization
Pericardium
Extracellular Matrix
Bioprosthesis
Keywords in spanish: Cardiopatías
Pericardio
Matriz Extracelular
Bioprótesis
keywords: Bioprótese valvares
Descelularização
Pericárdio Bovino
DeCS: Cardiopatias
Pericárdio Bovino
Matriz Extracelular
Issue Date: 2017
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: HEUSCHKEL, Marina Augusto. Avaliação histológica e de biocompatibilidade do pericárdio bovino após processo de descelularização branda para uso em biopróteses valvares. 2017. 76 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Curitiba
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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