Caracterização de Actina 4 de Trypanosoma cruzi

Abstract

A actina é uma proteína altamente conservada que participa em inúmeras funções essenciais tais como motilidade celular, citocinese, tráfego de vesículas e remodelamento da cromatina. Análises in silico do genoma do protozoário Trypanosoma cruzi identificaram quatro genes que codificam actinas (TcAct), nomeadas como actinas 1, 2, 3 e 4. Entretanto, esta anotação foi baseada em análises de similaridade, sem que nenhuma caracterização em termos funcionais tenha sido realizada. Nesse trabalho, caracterizamos a actina 4 de T. cruzi (TcAct4). Apesar de possuir similaridade com actinas de outros eucariotos, TcAct4 é a menos conservada quando comparada às outras actinas de T. cruzi (similaridade inferior a 50%). O gene que codifica a actina 4 (TcAct4) não possui ortólogo em T. brucei, porém possui ortólogos em outros tripanosomatídeos, dentre os quais as diferentes espécies do gênero Leishmania. A análise do padrão de expressão de TcAct4 por western blot mostrou que essa proteína é expressa em todas as fases do ciclo de vida do parasita. Análises por imunofluorescência e por microscopia eletrônica mostraram que TcAct4 apresenta um padrão disperso por todo o citoplasma e, frequentemente, associada com estruturas citoplasmáticas discretas, que em alguns casos, se assemelham a pequenos segmentos lineares, compatíveis com microfilamentos curtos ao longo do corpo celular do parasita. TcAct4 foi identificada majoritariamente na fração solúvel de extratos protéicos de T. cruzi, sugerindo que esta proteína não se encontra na forma filamentosa. Uma linhagem de T. cruzi mutante para TcAct4 (TcAct4 KO) foi gerada pela técnica de CRISPR-Cas9. Os parasitas TcAct4 KO apresentam alterações ultraestruturais, tais como intensa formação de vesículas de conteúdo elétron-denso e com aspecto de corpos multivesiculares, sugerindo que TcAct4 é importante para os processos de formação e/ou transporte de vesículas. Além disso, a organização da mitocôndria parece ter sido afetada, bem como a proliferação das formas epimastigotas dos parasitas TcAct4 KO, que foi significativamente reduzida. Contudo, a morfologia externa dos epimastigotas, bem como os processos de diferenciação e infectividade não foram alterados. Ensaios de imunoprecipitação de TcAct4 seguidos da análise por espectrometria de massas identificaram proteínas de diversas vias metabólicas e processos celulares, algumas delas envolvidas com tráfego de vesículas e translocação de proteínas para a mitocôndria, processos que se bloqueados são compatíveis com os fenótipos encontrados nos parasitas TcAct4 KO.