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Title: Caracterização de Actina 4 de Trypanosoma cruzi
Advisor: Medeiros, Lia Carolina Soares
Fragoso, Stenio Perdigão
Authors: Rosa, Jaqueline de Oliveira
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A actina é uma proteína altamente conservada que participa em inúmeras funções essenciais tais como motilidade celular, citocinese, tráfego de vesículas e remodelamento da cromatina. Análises in silico do genoma do protozoário Trypanosoma cruzi identificaram quatro genes que codificam actinas (TcAct), nomeadas como actinas 1, 2, 3 e 4. Entretanto, esta anotação foi baseada em análises de similaridade, sem que nenhuma caracterização em termos funcionais tenha sido realizada. Nesse trabalho, caracterizamos a actina 4 de T. cruzi (TcAct4). Apesar de possuir similaridade com actinas de outros eucariotos, TcAct4 é a menos conservada quando comparada às outras actinas de T. cruzi (similaridade inferior a 50%). O gene que codifica a actina 4 (TcAct4) não possui ortólogo em T. brucei, porém possui ortólogos em outros tripanosomatídeos, dentre os quais as diferentes espécies do gênero Leishmania. A análise do padrão de expressão de TcAct4 por western blot mostrou que essa proteína é expressa em todas as fases do ciclo de vida do parasita. Análises por imunofluorescência e por microscopia eletrônica mostraram que TcAct4 apresenta um padrão disperso por todo o citoplasma e, frequentemente, associada com estruturas citoplasmáticas discretas, que em alguns casos, se assemelham a pequenos segmentos lineares, compatíveis com microfilamentos curtos ao longo do corpo celular do parasita. TcAct4 foi identificada majoritariamente na fração solúvel de extratos protéicos de T. cruzi, sugerindo que esta proteína não se encontra na forma filamentosa. Uma linhagem de T. cruzi mutante para TcAct4 (TcAct4 KO) foi gerada pela técnica de CRISPR-Cas9. Os parasitas TcAct4 KO apresentam alterações ultraestruturais, tais como intensa formação de vesículas de conteúdo elétron-denso e com aspecto de corpos multivesiculares, sugerindo que TcAct4 é importante para os processos de formação e/ou transporte de vesículas. Além disso, a organização da mitocôndria parece ter sido afetada, bem como a proliferação das formas epimastigotas dos parasitas TcAct4 KO, que foi significativamente reduzida. Contudo, a morfologia externa dos epimastigotas, bem como os processos de diferenciação e infectividade não foram alterados. Ensaios de imunoprecipitação de TcAct4 seguidos da análise por espectrometria de massas identificaram proteínas de diversas vias metabólicas e processos celulares, algumas delas envolvidas com tráfego de vesículas e translocação de proteínas para a mitocôndria, processos que se bloqueados são compatíveis com os fenótipos encontrados nos parasitas TcAct4 KO.
Abstract: Actin is a highly conserved protein that participates in numerous essential functions such as cell motility, cytokinesis, vesicle trafficking, and chromatin remodeling. In silico analyses of the genome of the protozoan Trypanosoma cruzi identified four genes encoding for actin (TcAct), named as actin 1, 2, 3 and 4. However, this annotation was based on similarity analyses, without any functional characterization being fulfilled. In this work, we characterized the actin 4 of T. cruzi (TcAct4). Although it has similarity to other eukaryotic actins, TcAct4 is the least conserved when compared to other T. cruzi actins (similarity less than 50%). The gene encoding actin 4 (TcAct4) has no orthologous in T. brucei, but has orthologues in other trypanosomatids, including different species of the genus Leishmania. Western blot analysis showed that TcAct4 is expressed in all stages of the parasite life cycle. Immunofluorescence and electron microscopy analyses showed that localization of TcAct4 is dispersed throughout the cytoplasm and often associated with discrete cytoplasmic structures, which in some cases resemble small linear segments compatible with short microfilaments along the parasite's cell body. TcAct4 was identified mainly in the soluble fraction of T. cruzi protein extracts, suggesting that this protein is not present in the filamentous form. A T. cruzi mutant strain for TcAct4 (TcAct4 KO) was generated by CRISPR-Cas9 methodology. TcAct4 KO parasites presented ultrastructural alterations, such as intense formation of electron-dense vesicles with an aspect of multivesicular bodies, suggesting that TcAct4 may be important for vesicle formation/transport processes. In addition, mitochondrial organization was also affected, and TcAct4 KO proliferation of the epimastigote forms was significantly reduced. However, the external morphology of the epimastigote forms, as well as processes of differentiation and infectivity were not altered. TcAct4 immunoprecipitation assays followed by mass spectrometric analysis identified proteins that are involved in various metabolic pathways and cellular processes such as vesicle trafficking and proteins translocation to the mitochondria, processes that once blocked could lead to phenotypes compatible with those found in the TcAct4 KO parasites.
Keywords: Actins
Parasitology
Actin-Related Protein Complex
Keywords in spanish: Parasitología
Complejo Proteico Relacionado con la Actina
keywords: Trypanosoma Cruzi
Proteínas Relacionadas à Actina - ARPs
DeCS: Actinas
Parasitologia
Complexo de Proteínas Relacionadas à Actina
Issue Date: 2018
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: ROSA, Jaqueline de Oliveira. Caracterização da Actina 4 de Trypanosoma cruzi. 2018. 73 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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