Please use this identifier to cite or link to this item: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32060
Title: O efeito do silenciamento gênico de Pumilio na pluripotência e cardiomiogênese de células-tronco embrionárias humanas
Advisor: Shigunov, Patrícia
Gradia, Daniela Fiori
Authors: Silva, Isabelle Leticia Zaboroski
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A regulação pós transcricional em células-tronco embrionárias (ESC) desempenha um papel fundamental em diferentes processos biológicos. Diversos trabalhos demonstram que múltiplos mRNAs são co-regulados por uma ou mais proteínas de ligação a RNA (RBPs) que orquestram sua expressão. As proteínas PUF formam uma família de RBPs evolutivamente conservadas e as proteínas Pumilio (membros dessa família) têm sido associadas com a manutenção do estado indiferenciado de células germinativas. Em humanos, são encontrados dois homólogos dessa família: PUM1 e PUM2. Em estudos com hESC, PUM2 parece estar associada ao estado indiferenciado dessas células, sendo mais expressa em relação a PUM1. Para buscar entender o papel destas duas proteínas em hESC, esse trabalho teve como objetivo o silenciamento gênico de PUM1 e PUM2 em hESC, tanto na forma indiferenciada quanto durante a diferenciação cardiomiogênica, utilizando o sistema lentiviral. A expressão de PUM1 e PUM2 foi analisada ao longo do processo de cardiomiogênese. Ambos mRNAs apresentam um aumento da sua expressão em nível de RNA total ao longo da diferenciação. Após estas análises, a estratégia de silenciamento gênico foi empregada. Os lentivírus utilizados como ferramenta no processo de silenciamento foram produzidos em células HEK293FT, contendo o vetor pLKO-1. Esse vetor contém sequências de shRNA que reconhecem o mRNA de PUM1 ou PUM2. As hESC foram silenciadas utilizando os vetores lentivirais na diluição determinada na titulação, e, após 24 horas de transdução, RNA e proteínas foram extraídos para análise dos efeitos do silenciamento de PUMILIO em hESC. O silenciamento foi confirmado pela análise da expressão de PUM1 e PUM2 por qPCR. Foi observado também por qPCR que genes relacionados a pluripotência; OCT4 e NANOG, sofreram uma diminuição nos seus níveis de mRNA. Para análise dos efeitos do silenciamento durante cardiomiogênese, RNA foi extraído de 3 pontos ao longo do processo de diferenciação (dias 1, 4 e 9). O silenciamento de PUMILIO não se manteve ao longo do processo de diferenciação, porém a eficiência de diferenciação aumentou nas células silenciadas. Esse resultado indica que PUMILIO pode ter um papel no início da diferenciação, até mesmo na manutenção da pluripotência. Alvos de Pumilio podem estar livres no citoplasma ou associados à polissomos, indicando que estão sendo traduzidos. A análise de ontologia gênica dos mRNAs nestas duas frações poderia sugerir quais estão participando do processo de diferenciação. NFIA (Nuclear Factor I A), um gene que codifica um fator de transcrição descrito como regulador da via Notch, participando no desenvolvimento de mesoderme e linhagem cardíaca, é um alvo de PUMILIO. NFIA mostou-se aumentado durante a diferenciação cardiomiogênica. Os dados obtidos nesse trabalho sugerem que PUMILIO participe da regulação da pluripotência e cardiomiogênese de hESC.
Abstract: Post transcriptional regulation in embryonic stem cells (ESC) plays a key role in different biological processes. Several works demonstrate that multiple mRNAs are co-regulated by one or more RNA binding proteins (RBPs) that orchestrate their expression. PUF proteins form a family of evolutionarily conserved RBPs and Pumilio proteins (members of this family) have been associated with maintenance of undifferentiated germ cell status. In humans, two homologues of this family are found: PUM1 and PUM2. In studies with hESC, PUM2 appears to be associated with the undifferentiated state of these cells, being more expressed in relation to PUM1. In order to understand the role of these two proteins in hESC, this work aimed to gene silencing of PUM1 and PUM2 in hESC, both in undifferentiated form and during cardiomiogenic differentiation, using the lentiviral system. Expression of PUM1 and PUM2 was analyzed through cardiomyogenesis process. Both mRNAs show an increase in their expression at the level of total RNA throughout the differentiation. After these analyzes, gene silencing strategy was employed. Lentiviruses used as a tool in silencing process were produced in HEK293FT cells, containing vector pLKO-1. This vector contains shRNA sequences that recognize the mRNA of PUM1 or PUM2. hESC were silenced using the lentiviral vectors at dilution determined in the titration, and after 24 hours of transduction, RNA and proteins were extracted to analyze the effects of silencing of PUMILIO on hESC. Silencing was confirmed by analysis of the expression of PUM1 and PUM2 by qPCR. Genes related to pluripotency; OCT4 and NANOG decreased in their mRNA levels. For analysis of the effects of silencing during cardiomyogenesis, RNA was extracted from 3 points throughout the differentiation process (days 1, 4 and 9). Silencing of PUMILIO was not maintained through differentiation process, but the efficiency of differentiation increased in the silenced cells. This result indicates that PUMILIO may play a role early in differentiation, even in maintenance of pluripotency. Pumilio targets may be free in the cytoplasm or associated with polysomes, indicating that they are being translated. Genetic ontology analysis of the mRNAs in these two fractions could suggest which are participating in the differentiation process. NFIA (Nuclear Factor IA), a gene that encodes for transcription factor described as regulator of the Notch pathway, participating in the development of mesoderm and cardiac lineage, is a target of PUMILIO. NFIA was increased during cardiomyogenic differentiation. The data obtained in this study suggest that PUMILIO participates in the regulation of pluripotency and cardiomyogenesis of hESC.
Keywords: Embryonic Stem Cells
Myocytes
Cardiac
Keywords in spanish: Células Madre Embrionarias
Miocitos Cardíacos
keywords: Cardiomiogênese
Pumilio
DeCS: Células-Tronco Embrionárias
Miócitos Cardíacos
Issue Date: 2018
Citation: SILVA, Isabelle Leticia Zaboroski. O efeito do silenciamento gênico de Pumilio na pluripotência e cardiomiogênese de células-tronco embrionárias humanas. 2018. 125 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dissert_IsabelleSilva.pdf12.85 MBAdobe PDFView/Open



FacebookTwitterDeliciousLinkedInGoogle BookmarksBibTex Format mendeley Endnote DiggMySpace

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.