Avaliação de peptídeos biologicamente ativos, derivados da matriz extracelular para tratamen-to de camundongos distróficos

Abstract

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) atinge 1 a cada 3600 a 600 meninos nascidos vivos e é uma doença genética ligada ao cromossomo X. Ela é causada por mutações no gene da distrofina, levando ao comprometimento na expressão da distrofina, proteína que estabiliza o sarcolema durante a contração. Na DMD, ocorre uma degeneração e fraqueza muscular pro-gressiva, resultando na perda da função muscular, complicações cardiorrespiratórias e a morte em torno aos 20 anos de idade. A laminina-111(LAM-111) foi proposta para DMD como uma efetiva terapia baseada em proteína, prevenindo a patologia em camundongos mdx, modelo animal da doença. Uma proteólise parcial de proteínas da matriz extracelular, como a lamini-na-111, produz peptídeos chamados matricinas e vários deles são capazes de modular ativida-des celulares. Nesse estudo avaliamos o efeito biológico dos peptídeos derivados da LAM-111 em mioblastos e do peptídeo SIKVAV ou da LAM-111 em músculos distróficos de mdx. Para avaliar a adesão de mioblastos, nós incubamos a linhagem celular C2C12 em placas pré-tratadas com 1\03BCg de LAM-111 ou seus peptídeos e bloqueada com BSA. O peptídeo AG73 foi capaz de promover a adesão assim como a LAM-111. Depois disso, avaliamos a migração de mioblastos com ensaio de Transwell, a LAM-111 e seus peptídeos foram incubados com 1, 50 ou 100 \03BCg na câmara inferior. Na parte superior colocamos as células em meio sem soro. Depois de 16 horas, contamos as células migrantes O AG73 e a LAM-111 promoveram a adesão como o controle positivo de migração com soro. Para avaliar a diferenciação, nós cul-tivamos mioblastos C2C12 em placas tratadas com 10 \03BCg de LAM-111 e seus peptídeos e induzimos a diferenciação por três dias. Interessantemente, o AG73 aumentou a hipertrofia dos miotubos, o que não foi observado em outras condições. Para avaliação de proliferação nos tempos de 24 e 48 horas, os mioblastos foram incubados em placas tratadas com 1 ou 10 \03BCg de LAM-111 ou peptídeos. Não foram observadas diferenças entre os grupos. Devido aos efeitos biológicos relevantes do peptídeo SIKVAV descritos na literatura, avaliamos o efeito protetor desse fragmento ou da LAM-111 in vivo no modelo animal da DMD com ou sem o dano induzido por CTX. Para isso, camundongos mdx de 3 a 4 semanas receberam 100\03BCL de peptídeo SIKVAV (0,1\03BCg/mL) ou LAM-111 (100 \03BCM) nas patas direitas e nas patas esquer-das, tampão fosfato (PBS). Depois de três dias, os músculos foram coletados para análise ou foram exacerbados em dano com 100\03BCL de cardiotoxina (CTX)(10\03BCM), e depois outras cole-tas foram realizadas, no quarto e no décimo dia após à injúria. Os tratamentos foram capazes de reduzir os linfócitos no quarto dia após a CTX. A fibrose é um importante evento patológi-co da doença, o tratamento com LAM-111 foi capaz de reduzir a fibrose no decimo dia após a CTX e o dano seguido de regeneração no quarto dia. Em suma, o peptídeo AG73 demostrou in vitro efeitos biológicos relevantes a fisiologia muscular. E o peptídeo SIKVAV não mos-trou efeito protetor em músculos distróficos danificados com CTX.