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Title: Avaliação de peptídeos biologicamente ativos, derivados da matriz extracelular para tratamen-to de camundongos distróficos
Advisor: Pons, Andrea Henriques
Members of the board: Riederer, Ingo
Mermelstein, Cláudia dos Santos
Cruz, Daniella Arêas Mendes da
Pereira, Mirian Claudia de Souza
Brunswick, Tais Hanae Kasai
Authors: Horita, Samuel Iwao Maia
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A distrofia muscular de Duchenne (DMD) atinge 1 a cada 3600 a 600 meninos nascidos vivos e é uma doença genética ligada ao cromossomo X. Ela é causada por mutações no gene da distrofina, levando ao comprometimento na expressão da distrofina, proteína que estabiliza o sarcolema durante a contração. Na DMD, ocorre uma degeneração e fraqueza muscular pro-gressiva, resultando na perda da função muscular, complicações cardiorrespiratórias e a morte em torno aos 20 anos de idade. A laminina-111(LAM-111) foi proposta para DMD como uma efetiva terapia baseada em proteína, prevenindo a patologia em camundongos mdx, modelo animal da doença. Uma proteólise parcial de proteínas da matriz extracelular, como a lamini-na-111, produz peptídeos chamados matricinas e vários deles são capazes de modular ativida-des celulares. Nesse estudo avaliamos o efeito biológico dos peptídeos derivados da LAM-111 em mioblastos e do peptídeo SIKVAV ou da LAM-111 em músculos distróficos de mdx. Para avaliar a adesão de mioblastos, nós incubamos a linhagem celular C2C12 em placas pré-tratadas com 1\03BCg de LAM-111 ou seus peptídeos e bloqueada com BSA. O peptídeo AG73 foi capaz de promover a adesão assim como a LAM-111. Depois disso, avaliamos a migração de mioblastos com ensaio de Transwell, a LAM-111 e seus peptídeos foram incubados com 1, 50 ou 100 \03BCg na câmara inferior. Na parte superior colocamos as células em meio sem soro. Depois de 16 horas, contamos as células migrantes O AG73 e a LAM-111 promoveram a adesão como o controle positivo de migração com soro. Para avaliar a diferenciação, nós cul-tivamos mioblastos C2C12 em placas tratadas com 10 \03BCg de LAM-111 e seus peptídeos e induzimos a diferenciação por três dias. Interessantemente, o AG73 aumentou a hipertrofia dos miotubos, o que não foi observado em outras condições. Para avaliação de proliferação nos tempos de 24 e 48 horas, os mioblastos foram incubados em placas tratadas com 1 ou 10 \03BCg de LAM-111 ou peptídeos. Não foram observadas diferenças entre os grupos. Devido aos efeitos biológicos relevantes do peptídeo SIKVAV descritos na literatura, avaliamos o efeito protetor desse fragmento ou da LAM-111 in vivo no modelo animal da DMD com ou sem o dano induzido por CTX. Para isso, camundongos mdx de 3 a 4 semanas receberam 100\03BCL de peptídeo SIKVAV (0,1\03BCg/mL) ou LAM-111 (100 \03BCM) nas patas direitas e nas patas esquer-das, tampão fosfato (PBS). Depois de três dias, os músculos foram coletados para análise ou foram exacerbados em dano com 100\03BCL de cardiotoxina (CTX)(10\03BCM), e depois outras cole-tas foram realizadas, no quarto e no décimo dia após à injúria. Os tratamentos foram capazes de reduzir os linfócitos no quarto dia após a CTX. A fibrose é um importante evento patológi-co da doença, o tratamento com LAM-111 foi capaz de reduzir a fibrose no decimo dia após a CTX e o dano seguido de regeneração no quarto dia. Em suma, o peptídeo AG73 demostrou in vitro efeitos biológicos relevantes a fisiologia muscular. E o peptídeo SIKVAV não mos-trou efeito protetor em músculos distróficos danificados com CTX.
Abstract: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) affects 1 in 3600 to 6000 male births and is an X-linked recessive disorder. It is caused by mutations in the dystrophin gene, leading to the lack of dystrophin expression, a protein that stabilizes the sarcolemma during muscle contraction. In DMD, there is a progressive muscle weakness and wasting, resulting in loss of motor func-tion, cardiorespiratory complications and death in the 20s. Laminin-111(LAM-111) was pro-posed as an effective protein-based therapy for DMD, as it prevents the pathology in mdx mice, a murine model for the disease. Furthermore, it improved myoblast transplantation ther-apy in mdx mice. Partial proteolysis of matrix extracellular proteins, as LAM-111, produces peptides called matrikines and many of them can modulate cell activity. In this study, we in-vestigate the biological effect of laminin-derived peptides or LAM-111 in myoblasts in vitro and the treatment in dystrophic muscles of mdx mice with LAM-111 or SIKVAV peptide in vivo. To evaluate the myoblast adhesion, C2C12 cell line was incubated in a plate with 1\03BCg of LAM-111 or its derived peptides with BSA blocking. The peptide AG73 was able to promote the myoblast adhesion as LAM-111. Next, we evaluated the myoblast migration using Transwell assay, the LAM-111 or peptides were incubated 1, 50 or 100 \03BCg in the bottom chamber On the upper chamber, we incubated C2C12 with serum free medium. After 16 hours, we counted the cells in the lower part of membrane. The peptide AG73 and LAM-111 improved myoblast migration as the positive control with serum. To evaluate the myogenic differentiation, we seeded C2C12 cell line in a plate coated with 10\03BCg LAM-111 or peptides and we induced differentiation until the third day. Interestingly, the peptide AG73 enhanced the miotube\2019s diameter but not the other conditions. Next, we cultivate the myoblasts in a plate coated with 1 or 10\03BCg of LAM-111 or peptides for evaluation of proliferation after 24 and 48 hours. We did not observe any differences between the groups. Due the biological ef-fects of SIKVAV described in literature, we evaluate the protective effect of this peptide or laminin-111 in mdx muscles damaged or not with cardiotoxin (CTX). For this, mdx mice with 3 to 4 weeks of age received 100\03BCL of SIKVAV (0,1\03BCg/mL) or LAM-111 (100\03BCM) in right side legs, in other side they received phosphate buffered saline (PBS). After three days, a group of muscles was harvested, and the other groups was injected with 100\03BCL of CTX (10\03BCM), the muscles were collected at 4 or 10 days after CTX-induced injury. The treatments reduced the lymphocytes population in muscles in the fourth day after CTX-induced injury. Fibrosis is an important hallmark in DMD and the treatment of LAM-111 was able to reduce excessive collagen deposition at 10 days after CTX-induced damage. Furthermore, LAM-111 improved the muscle damage followed by regeneration in forth day after CTX. In conclusion, AG73 peptide demonstrated important biological effects in myoblasts and SIKAV does not have a protective effect in dystrophic muscles damaged with CTX.
keywords: Matriz Extracelular
Laminina
Peptídeos
Distrofia Muscular de Duchenne
DeCS: Distrofia Muscular de Duchenne
Matriz Extracelular
Issue Date: 2018
Citation: HORITA, Samuel Iwao Maia. Avaliação de peptídeos biologicamente ativos, derivados da matriz extracelular para tratamento de camundongos distróficos. 2018. 88 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: restricted access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Dissertações de Mestrado

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