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Title: Caracterização da histona desacetilase 2 (TgHDAC2) de Toxoplasma gondii
Advisor: Nardelli, Sheila Cristina
Authors: Siqueira, Caroline de Moraes de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: A desacetilação de histonas é uma forma de regulação epigenética que está associada ao silenciamento gênico, uma vez que a remoção de grupos acetil por histona desacetilases (HDACs) resultam em uma cromatina mais condensada. Em Toxoplasma gondii (T. gondii) pouco se sabe sobre estas enzimas, mas acredita-se que elas são uma parte essencial da regulação da expressão gênica. T. gondii possui 7 HDACs, incluindo TgHDAC2, o objeto do nosso estudo. Embora seja considerada uma HDAC clássica de classe I, muito semelhante a outros eucariotos, a TgHDAC2 possui duas inserções aminoacídicas dentro do domínio HDAC característico, algo exclusivo de alguns membros do filo Apicomplexa, e cuja função permanece desconhecida. Além disso, resultados de RNA-seq depositados na base de dados de T. gondii mostram um aumento da expressão de TgHDAC2 durante a fase S do ciclo celular. Para caracterizá-la, obtivemos o nocaute de tghdac2, o qual foi substituído pelo gene hxgprt através de recombinação homóloga. Até o momento, observamos menor infectividade e taxa de proliferação de parasitas Δtghdac2, sugerindo um papel durante a progressão do ciclo celular, possivelmente durante a fase S. Também notamos que os parasitas Δtghdac2 se apresentavam desorganizados no vacúolo parasitóforo, possivelmente devido a defeitos no ciclo celular. Para confirmar estas hipóteses, foi feita uma análise de ciclo celular por citometria de fluxo, onde observamos enriquecimento de parasitas nocaute na fase S do ciclo celular, além de maior taxa de incorporação de EdU evidenciando algum defeito ou atraso nesta fase. Com o objetivo de analisar o nível de acetilação de histonas conservadas nos parasitas Δtghdac2, foram feitos ensaios de Western blot para histonas H3 e H4 acetiladas, porém não mostraram diferenças estatísticas nos níveis de acetilação na ausência de TgHDAC2, indicando que ela não é responsável por desacetilar estas histonas. Contudo, não podemos descartar que a TgHDAC2 possa ter outras histonas como alvo ou ainda outros substratos. Além disso, dados de dicroísmo circular foram realizados a fim de desvendar a estrutura secundária das inserções aminoacídicas presentes no domínio HDAC, e indicaram que ela é uma proteína enovelada, monomérica e estável até em altas temperaturas. O etiquetamento da proteína endógena não obteve sucesso, não sendo possível a detecção por Westen Blot ou imunofluorescência. Entretanto, a superexpressão de TgHDAC2 mostrou uma localização celular nuclear em ensaios de imunofluorescência, contudo a fusão com a etiqueta de GFP não pode ser detectada por Western Blot. Apesar da necessidade de mais experimentos, nossos dados sugerem uma função na progressão do ciclo celular possivelmente na replicação do DNA.
Abstract: Histone deacetylation is a form of epigenetic regulation that is associated with gene silencing, since the removal of acetyl groups by histone deacetylases (HDACs) results in a more condensed chromatin. In Toxoplasma gondii (T. gondii) little is known about these enzymes, but they are believed to be an essential part of the regulation of gene expression. T. gondii has 7 HDACs, including TgHDAC2, the object of our study. Although TgHDAC2 is considered a classic class I HDAC, very similar to other eukaryotes, TgHDAC2 has two amino acid insertions within the characteristic HDAC domain, which is unique to some members of the Apicomplexa phylum and whose function remains unknown. In addition, available transcription expression data show an increase in TgHDAC2 expression during the S phase of the cell cycle. To characterize it, we obtained the knockout of tghdac2, which was replaced by the hxgprt gene by homologous recombination. To date, we have observed lower infectivity and proliferation rate of Δtghdac2 parasites, suggesting a role during cell cycle progression, possibly during S phase. We also noticed that Δtghdac2 parasites were disorganized in the parasitoid vacuole, possibly due to defects in the cell cycle. To confirm these hypotheses, a cell cycle analysis was performed by flow cytometry, where we observed enrichment of knockout parasites in the S phase of the cell cycle, in addition to a higher incorporation rate of EdU showing some defect or delay in this phase. In order to analyze the level of histone acetylation conserved in Δtghdac2 parasites, Western blot assays were performed for histone H3 and H4 acetylated, but did not show statistical differences in acetylation levels in the absence of TgHDAC2, indicating that it is not responsible for deacetylating these residues. However, we cannot rule out that TgHDAC2 may have other target histones or other substrates. In addition, circular dichroism analysis was performed on the recombinant TgHDAC2 in order to uncover the secondary structure of the amino acid inserts present in the HDAC domain, and indicated that it is a monomeric, enveloped protein and stable even at high temperatures. The tagging of the endogenous protein was not successful and it was not possible to detect by Westen Blot or immunofluorescence. However, the overexpression of GFP-tagged TgHDAC2 showed a nuclear cell localization in immunofluorescence assays, however, it could not be detected by Western Blot. Although further experiments are undergoing in the lab, our preliminary data suggest a role in cell cycle progression, possibly by interfering in DNA replication.
Keywords: Parasitology
Epigenomics
Gene Expression Regulation
Histones
Histone Code
Keywords in spanish: Parasitología
Epigenómica
Regulación de la Expresión Génica
keywords: Toxoplasma
Toxoplasma gondii
Epigenética
DeCS: Parasitologia
Epigenômica
Regulação da Expressão Gênica
Histonas
Código de Histonas
Issue Date: 2018
Citation: SIQUEIRA, Caroline de Moraes de. Caracterização da histona desacetilase 2 (TgHDAC2) de Toxoplasma gondii. 2018. 109 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, PR, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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