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Title: Desenvolvimento de método molecular em plataforma Lab-on-a-chip para diagnóstico de micro-organismos associados à sepse
Advisor: Krieger, Marco Aurélio
Authors: Carvalho, Taís Franco de
Coadvisor: Morello, Luís Gustavo
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: Sepse é a disfunção múltipla de órgãos causada pela resposta inflamatória desregulada do corpo a uma infeção. É a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva no mundo, o que é associado a falta de diagnóstico e tratamento eficiente e no tempo adequado. Hemocultura é o padrão ouro para diagnóstico de infecções da corrente sanguínea. No entanto, ela demanda de 3 a 7 dias para o resultado final. A administração de antimicrobianos antes da coleta de amostras de sangue e o crescimento fastidioso de certos patógenos também tornam esse método não apropriado para guiar a terapia de forma correta. Logo, avanços têm sido feitos em biologia molecular para oferecer alternativas mais rápidas e sensíveis. De acordo com a literatura, testes baseados em PCR diretamente do sangue total são considerados os mais promissores dentre eles. Desenvolvemos nesse projeto um multiteste PCR/Arranjo que alia a amplificação por PCR com hibridização de ácidos nucleicos em Lab-on-a-chip (In-CheckTM platform, STMicroelectronics). Os micro-organismos cobertos no painel foram selecionados de acordo com dados epidemiológicos nacionais. Sequências do genoma destes micro-organismos foram obtidas de bancos de dados e sequenciamentos e alinhadas para o desenho de iniciadores e sondas. Iniciadores foram gerados para reconhecer e amplificar regiões conservadas com variação interna onde as sondas foram desenhadas para detectar e diferenciar cada espécie. Para avaliar e otimizar iniciadores e sondas assim como o protocolo de PCR e de hibridização, foi utilizado DNA extraído de patógenos em cultivo previamente caracterizados com metodologias tradicionais de microbiologia e sequenciamento. Especificidade e sensibilidade analítica foram investigadas usando DNA extraído de sangue artificialmente contaminado com concentrações conhecidas de micro-organismos. O protótipo final identifica 22 espécies de bactérias e 5 espécies de Candida spp. Adicionalmente, sondas universais diferenciam bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e o gênero Candida. O limite de detecção do teste é de 10 a 1000 UFC/mL, o que tem valor clínico considerando concentrações de bactéria reportadas em sangue periférico de pacientes sépticos. O teste pode prover a detecção mais rápida e precisa de agentes causadores de sepse, permitindo tratamento mais eficiente antes da progressão para choque séptico e potencialmente contribuindo para reduzir taxa de mortalidade. Também promove uso consciente de antimicrobianos, reduzindo seleção de cepas resistentes.
Abstract: Sepsis is the multiple organ dysfunction syndrome caused by an irregular body inflammatory response to an infection. It is considered the major cause of death in intensive care units worldwide, which is associated to the lack of appropriate and timely diagnosis and treatment. Blood culturing is the current gold standard technique for blood stream infection (BSI) diagnosis. However, generally takes 3 to 7 days to a final result and antimicrobial administration prior to collection and fastidious pathogens render this method unsuitable to guide therapy properly. Therefore, advances have been made in molecular biology to offer more sensitive and fast alternatives. According to the literature, PCR-based tests directly from whole blood are considered the most promising among them. We developed a PCR/Array-based multitest that allies PCR amplification and hybridization of nucleic acids in a Lab-ona-chip (In-CheckTM platform, STMicroelectronics). The microorganisms covered in the panel were selected according to the national epidemiology data. Sequences of the genome from the microorganisms on the test’s panel were retrieved from the data bank and aligned for primers and probes design. Primers were generated to target and amplify conserved regions spanning internal variability that allowed probes to be designed to detect and differentiate each species. To evaluate and optimize probes and primers as well as PCR amplification and hybridization protocols, DNA extracted from cultured pathogens previously characterized with traditional microbiology techniques and sequencing was used. Analytical specificity and sensitivity were investigated using DNA extracted from whole blood artificially spiked with known cell density of microorganisms. The final prototype showed the ability to identify 22 species of bacteria, and 5 species of Candida spp. Additionally, universal probes were added to differentiate Gram-negative and Gram-positive bacteria and the genus Candida. The detection limit for the tested microorganisms is between 10 and 1000 CFU/mL, which has clinical value considering reported bacteria density in peripheral blood of septic patients. The test may provide faster and more accurate detection of the sepsis-causing agents, allowing more efficient treatment before progression to septic shock and potentially contributing to reduce mortality rates. It also has the benefit of promoting antimicrobial stewardship that limits the selection of resistant strains.
Keywords: Sepsis
Systemic Inflammatory Response Syndrome
Blood Culture
Polymerase Chain Reaction
Keywords in spanish: Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica
Cultivo de Sangre
Reacción en Cadena de la Polimerasa
keywords: Hemocultura
DeCS: Sepse
Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica
Reação em Cadeia da Polimerase
Issue Date: 2018
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: CARVALHO, Taís Franco de. Desenvolvimento de método molecular em plataforma Lab-on-a-chip para diagnóstico de micro-organismos associados à sepse. 2018. 86 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, PR, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Dissertações de Mestrado

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