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Title: Estudos sobre a S-palmitoilação de proteínas em Trypanosoma cruzi
Advisor: Soares, Maurilio José
Eger, Iriane
Authors: Batista, Cassiano Martin
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: S-palmitoilação é uma modificação proteica pós-traducional que consiste na adição de ácido palmítico a resíduos de cisteína através de ligação tioéster, regulando assim a localização subcelular e função das proteínas palmitoiladas, principalmente a inserção em membranas por conferir hidrofobicidade. Objetivo desta tese foi realizar um estudo global da S-palmitoilação em Trypanosoma cruzi. Análise in silico identificou 15 proteínas contendo o motivo DHHC ou DHYC em um domínio rico em císteína, além de regiões transmembrana, indicando que estas proteínas podem ser DHHC palmitoil transferases (PATs) de T. cruzi. Os genes codificantes para estas proteínas (TcPATs 1-15) foram identificados e amplificados por PCR, exceto para TcPAT1 (TcHIP, já caracterizada) e TcPAT6 (negativa no PCR). Formas epimastigotas foram transfectadas para expressar PATs fusionadas à etiqueta FLAG e a localização subcelular foi examinada por microscopia de fluorescência, sendo a maioria localizada na região anterior do parasita, próximo ao cinetoplasto, compatível com complexo de Golgi, bolsa flagelar e/ou vacúolo pulsátil. A mesma estratégia identificou duas palmitoil tioesterases (PPTs) em T. cruzi, ambas com localização dispersa por todo o corpo do parasita. Também foi desenvolvida uma metodologia de isolamento de amastigotas intracelulares por cavitação, os quais foram utilizados em ensaios de endocitose, tratamento com um inibidor de S-palmitoilação (2-BP) e palmitoil proteômica. Incubação de diferentes formas de T. cruzi com 2-BP interferiu em diversos eventos biológicos (morfologia, endocitose, diferenciação e infecção in vitro), indicando que S-palmitoilação é uma modificação bioquímica importante para o parasita. Ensaios por Acyl Biotinyl Exchange (ABE) em epimastigotas permitiram obter dados sobre a palmitoil proteômica de T. cruzi (abordagem PalmPISC), sendo identificadas 3097 proteínas, das quais 466 (15%) de alta confidencia (p<0,01). Destas, 35% (152) tinham função desconhecida e 13% (59) eram de metabolismo. Estes dados podem auxiliar na compreensão da função da S-palmitoilação em T. cruzi, uma vez que diversas proteínas de interesse podem estar palmitoiladas e envolvidas em importantes vias metabólicas, tais como endocitose, sinalização celular e movimento flagelar.
Abstract: S-palmitoylation is an important post-translational protein modification consisting in addition of palmitic acid to cysteine residues, thus allowing the subcellular localization and function of palmitoylated proteins to be regulated, principally by inserting these proteins in membrane by hydrophobicity assembly. Aim of this thesis was to perform a global study of Spalmitoylation in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. In silico analysis allowed to identify 15 proteins containing the DHHC or DHYC motifs in a cysteine-rich domain, in addition to transmembrane regions, thus indicating that these proteins may be PATs of T. cruzi. Genes encoding these proteins (TcPATs 1 to 15) were identified and amplified by PCR, except for TcPAT1 (TcHIP, already characterized) and TcPAT6 (negative on PCRs). T. cruzi epimastigotes were transfected to super-express the PATs fused to FLAG tags and the subcellular location of PATs was determined by fluorescence microscopy, most of them showing localization in the anterior region of the parasite, close to the kinetoplast, compatible with Golgi complex, flagellar pocket or contractile vacuole. The same strategy was used identify two palmitoyl thioesterases (PPTs) in T. cruzi, both with subcellular location dispersed throughout the body of the parasite. A methodology was developed to isolate intracellular amastigotes by cavitation and these parasites were used in endocytosis assays, treatment with 2-bromopalmitate (2-BP, an S-palmitoylation inhibitor) and palmitoyl proteomics. Incubation of different T. cruzi developmental forms with 2-BP affected several biological events (morphology, endocytosis, differentiation and infection in vitro), indicating that palmitoylation is an important modification for the parasite. Acyl Biotinyl Exchange (ABE) assays in epimastigotes allowed to obtain data on the palmitoyl proteomic (PalmPISC approach) of T. cruzi, with 3097 proteins identified, 466 of them (15%) of high confidentiality (p <0.01). From these, 35% (152) had unknown function, and 13% (59) were part of metabolic pathways. The data could help future studies aiming to characterizae the Spalmitoylation function in T. cruzi, since several target proteins could be palmitoylated and involved in important metabolic pathways, such as endocytosis, cell signaling and flagellar movement.
Keywords: Cavitation
Parasitology
Proteomics
Keywords in spanish: Cavitación
Parasitología
Proteómica
keywords: Trypanosoma cruzi
S-palmitoilação
Bromopalmitato
DeCS: Cavitação
Parasitologia
Proteômica
Issue Date: 2018
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: BATISTA, Cassiano Martin. Estudos sobre a S-palmitoilação de proteínas em Trypanosoma cruzi. 2018. 122 f. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswadlo Cruz, Curitiba, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Teses de Doutorado

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