Please use this identifier to cite or link to this item: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32880
Title: Caracterização do secretoma cardíaco e sua influência no cultivo de células progenitoras
Advisor: Stimamiglio, Marco Augusto
Authors: Kulig, Anny Waloski Robert
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.
Abstract: O microambiente tecidual, composto especialmente por fatores solúveis e matriz extracelular (MEC), é capaz de regular o comportamento celular. Há grande interesse em entender a composição dos diferentes nichos teciduais e como eles são capazes de modular as respostas de diferentes tipos celulares. Com relação ao nicho cardíaco, ainda existem vários aspectos que precisam ser elucidados, como a caracterização dos sinais secretados que modulam o comportamento das células progenitoras residentes. Para tanto, diferentes abordagens podem ser propostas, como avaliar as moléculas secretadas por células derivadas de tecido cardíaco adulto ou durante o processo de diferenciação cardiomiogênica no período embrionário. Assim, o objetivo deste trabalho é caracterizar a composição proteica e avaliar o efeito biológico de meios condicionados (MCs) derivados de células residentes cardíacas (CRCs) e de células-tronco embrionárias (CTEs) durante o processo de diferenciação cardiomiogênica. Em relação aos fatores secretados por CRCs, foram realizadas caracterizações e análises proteômicas mostrando uma complexidade de proteínas e fatores solúveis. Ensaios funcionais com células progenitoras em cultivo demonstraram que o secretoma das CRCs é capaz de influenciar a proliferação e diferenciação de cardioblastos H9c2 e de células progenitoras endoteliais. Outro foco deste trabalho foi avaliar as alterações do microambiente e sinalizações celulares presentes durante o comprometimento das CTEs à linhagem cardíaca. Para isso, coletamos os MCs e a MEC em diferentes pontos durante o processo de diferenciação cardiomiogênica de CTEs (D1, D4, D8/D9 e D15 – referentes aos dias de diferenciação e surgimento de progenitores). A composição da MEC e dos MCs foi avaliada por espectrometria de massas e arranjo de anticorpos, respectivamente. Identificamos em torno de 40 proteínas de MEC moduladas nos diferentes tempos analisados e 20 fatores de crescimento e/ou citocinas nos MCs. Experimentos com células H9c2 mostraram que os meios, em momentos iniciais da diferenciação (D1, D4 e D8), possuem a capacidade de aumentar a taxa de proliferação destes mioblastos. Resultados similares foram verificados em células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo, porém apenas os meios dos dias 1 e 4 mostraram diferença significativa na proliferação em relação aos demais. Cultivos de células progenitoras endoteliais com os MCs demonstraram que todos eles têm o potencial em estimular a angiogênese, mas apenas aqueles do D1 e D4 conseguem promover migração das células de forma similar ao controle positivo. Com relação ao potencial em estimular a cardiomiogênese, nem o meio do D8 nem do D15 foram capazes de induzir a diferenciação de células H9c2 ou de melhorar o processo de diferenciação das CTEs. Então, além de apresentarem perfis proteicos específicos, os diferentes MCs utilizados neste trabalho influenciaram os progenitores de formas diferentes. Enquanto os MCs obtidos de CRCs apresentaram efeitos promissores em células progenitoras, os MCs obtidos durante a diferenciação cardíaca in vitro tiverem resultados pouco representativos sobre as células progenitoras avaliadas. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho que caracteriza o secretoma, incluindo proteínas da MEC, durante o processo in vitro de diferenciação cardiomiogênica de CTEs. Assim, os conhecimentos gerados neste trabalho podem contribuir tanto para o entendimento do processo de diferenciação e caracterização do nicho cardíaco, quanto para a busca de fatores para uso em terapias do sistema cardiovascular.
Abstract: Tissue microenvironment, composed remarkably by soluble factors and extracellular matrix (ECM), is able to regulate cell behavior. There is a great interest in understanding the composition of the different tissue niches and how they modulate cell behavior. Regarding the cardiac niche there are several aspects that still needs elucidation, such as the characterization of the secreted signals that modulate the behavior of resident progenitor cells. For this purpose, different approaches could be suggested, such as evaluating the molecules secreted by cells derived from adult cardiac tissue or during the process of cardiomyogenic differentiation in the embryonic period. Thus, the purpose of this work is to characterize the composition and evaluate the biological effects of the conditioned media (CMs) derived from cardiac resident cells (CRCs) and embryonic stem cells (ESCs) during the process of cardiomyogenic differentiation. In relation to the factors secreted by CRCs, characterizations and proteomic analyzes showed a complex group of soluble factors. Functional assays using progenitor cells demonstrated that the secretome of CRCs is able to influence the proliferation and differentiation of H9c2 cardioblasts and endothelial progenitor cells. Another focus of the study was to understand the alterations and signals of the microenvironment during the cellular compromise to cardiac lineage. For this purpose, we collected CMs and the ECM at different points during the ESC cardiomyogenic differentiation process (D1, D4, D8 / D9 and D15 - referring to the days of differentiation and progenitor emergence). The proteomic composition of the ECM and CMs was evaluated by mass spectrometry and antibody array, respectively. We identified around 40 modulated ECM proteins during the differentiation process and 20 growth factors and/ or cytokines in the CMs. Assays with H9c2 cells have shown that the CMs of early differentiation points (D1, D4, and D8) have the ability to increase the proliferation rate of these myoblasts. Similar results were observed with adipose-derived mesenchymal stem cells, but only the CMs of days 1 and 4 showed significant differences on cell proliferation in relation to the others. Moreover, endothelial progenitor cells cultured with CMs showed that all the CMs have the potential to stimulate angiogenesis, but only those of D1 and D4 can promote cell migration similarly to the positive control. Regarding the potential to stimulate cardiomyogenesis, neither CMs from D8 nor D15 were able to induce the differentiation of H9c2 cells or to improve the differentiation process of the ESCs. Thus, in addition to specific protein profiles, the different CMs used in this work influence progenitor cells in different ways. While CMs obtained from CRCs showed promising effects on progenitor cells, CMs obtained during in vitro cardiac differentiation of ESCs have poorly representative results on the progenitor cell types tested. In our knowledge, this is the first work that characterizes soluble factors and ECM secreted during in vitro cardiomyogenic differentiation of ESCs. Thus, the knowledge generated here contributes to both the understanding of the cardiomiogenic differentiation process and the cardiac niche characterization, as well as to the search for factors to be used in cardiovascular system therapy.
Keywords: Stem Cells
Embryonic Stem Cells
Myocytes
Extracellular Matrix
Keywords in spanish: Células Madre
Células Madre Embrionarias
Miocitos Cardíacos
keywords: Diferenciação cardíaca
Células residentes cardíacas
Secretoma
DeCS: Células-Tronco
Células-Tronco Embrionárias
Miócitos Cardíacos
Matriz Extracelular
Issue Date: 2018
Publisher: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
Citation: STIMAMIGLIO, Marco Augusto. Caracterização do secretoma cardíaco e sua influência no cultivo de células progenitoras. 2018. 178 f. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Curitiba/PR
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia
Copyright: open access
Appears in Collections:PR - ICC - Teses de Doutorado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Tese_Anny_Kulig.pdf16.93 MBAdobe PDFView/Open



FacebookTwitterDeliciousLinkedInGoogle BookmarksBibTex Format mendeley Endnote DiggMySpace

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.