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Title: Expressão da proteína recombinante RasGEF1b: um novo fator de troca de nucleotídeos guanina associado à proteína Ras induzido pelo Trypanosoma cruzi
Other Titles: Expression of the recombinant protein RasGEF1b: a new factor of guanina exchange of nucleotídeos associate to induced the Ras protein for the Trypanosoma cruzi
Advisor: Gazzinelli, Ricardo Tostes
Romanha, Alvaro José
Authors: Silveira, Tatiana Nunes
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract: RasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) hipotético e altamente conservado. Esse gene contém um domínio RASGEFN com um motivo zíper de leucina e um domínio RASGEF com três sítios de localização nuclear. A expressão do mRNA do RasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucina (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A fim de expressar a proteína recombinante, nós clonamos o cDNA do RasGEF1b no vetor pQE-30, utilizado para transformar bactérias E. coli (XL1-Blue). A His-RasGEF1b expressa em bactérias foi purificada utilizando tampão com alto conteúdo de uréia, seguido por cromatografia de afinidade utilizando resina carregada com níquel. A expressão da proteína foi confirmada em gel 2D, análise por espectometria de massa e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-His. Além disso, o cDNA do RasGEF1b foi inserido em um plasmídeo que permite a fusão do epitopo FLAG (pFLAGCMV2) com a proteína RasGEF1b. O pFLAGCMV2 codificando o cDNA do RasGEF1b foi utilizado para transfectar células HEK293T e a expressão protéica foi avaliada com gel 2D gel e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-FLAG. A proteína reconhecida pelo anti-FLAG mostrou um peso molecular aparente de 56 KDa e ponto isoelétrico de 7,25. Utilizando a técnica de centrifugação diferencial e anticorpos monoclonais para as proteínas específicas das diferentes frações subcelulares, nós demonstramos que a proteína FLAG-RasGEF1b estava presente principalmente nas frações de núcleo e de membranas pesadas. Através do alinhamento entre seqüências da RasGEF1b de diferentes espécies filogeneticamente distintas vimos que esta proteína é altamente conservada com similaridade de 57 por cento a 97 por cento em relação à RasGEF1b murina.
Abstract: rasgef1b is a highly conserved putative Guanine Exchange Factor (GEF) containing a RASGEFN domain with a leucine zipper and a RASGEF domain with three sites of nuclear localization. In macrophages expression of rasgef1b mRNA is induced by different TLR agonists, such as LPS (TLR4), GPI-mucin (TLR2) and Poli I:C (TLR3). In order to express the recombinant protein, we cloned the rasgef1b cDNA into a pQE30, used to transform E. coli (XL1Blue). The recombinant His-RasGEF1b expressed in bacteria was purified using high urea content buffer, followed affinity chromatography using a nickel resin. The expression of the His-RasGEF1b was confirmed in 2D gel, mass fingerprint analysis and Western blot using an anti-HIS mAb. In addition, the rasgef1b cDNA was inserted into a plasmid, which allows the insertion of the FLAG epitope (pFLAGCMV2) with the recombinant protein. The pFLAGCMV2 encoding the rasgef1b cDNA was used the transfect HEK293T cells and protein expression evaluated with 2D gel an Western blot using an anti-FLAG mAb. The protein recognized by the anti-FLAG showed and apparent molecular weight of 56 kDa and the predicted isoeletric point of 7.25. By using differential centrifugation, and mAbs specific proteins of different cellular fractions, we demonstrated that the protein FLAG-RasGEF1b was mainly present in the nuclear and heavy membrane fractions. Through the alignment among sequences of the RasGEF1b from phylogeneticlly distinct species we observed that this protein is highly conserved with similarity between 57% and 97% with the murin RasGEF1b.
keywords: Nucleotídeos guanina
Proteína recombinante RasGEF1b
Proteína Ras
Trypanosoma Cruzi
Issue Date: 2006
Citation: SILVEIRA, Tatiana Nunes. Expressão da proteína recombinante RasGEF1b: um novo fator de troca de nucleotídeos guanina associado à proteína Ras induzido pelo Trypanosoma cruzi. 2006. 95 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) - Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2006.
Date of defense: 2006
Place of defense: Belo Horizonte, MG, Brasil
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:MG - IRR - PPGCS - Dissertações de Mestrado

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