Aprimoramento da técnica de redução do sal de tetrazol XTT aplicada ao controle da viabilidade da vacina BCG produzida no Brasil

Abstract

A quantidade de bacilos viáveis presentes na vacina BCG é um importante requisito de qualidade deste produto, fazendo parte do controle exigido pela Coordenação Geral do Programa Nacional de Imunizações do Ministério da Saúde. Este controle objetiva avaliar a viabilidade dos bacilos no produto final, a estabilidade da vacina após stress térmico (termoestabilidade), além de permitir o monitoramento da consistência da produção. A contagem de colônias em meio sólido é o método oficial recomendado pela Organização Mundial da Saúde e pela Farmacopéia Brasileira para a determinação da viabilidade do BCG. A difícil dispersão do bacilo e seu crescimento lento conferem limitações ao método convencional, como a variabilidade dos resultados, a baixa reprodutibilidade e o prolongado tempo de análise. Este trabalho avaliou o método alternativo de redução do sal de tetrazol XTT modificado pelo uso de solução de cloreto de sódio 0,9% como diluente na determinação do número de viáveis em vacinas produzidas com BCG Moreau - RJ. O XTT é reduzido em formazana por ação enzimática das células metabolicamente ativas e a sua dosagem feita em leitor de ELISA. Por tratar-se de uma medida metabólica, a dosagem da formazana produzida proporcionalmente à respiração celular é um melhor indicador da viabilidade dos bacilos quando comparado aos métodos que dependem do cultivo e multiplicação celular. Foi demonstrada a redução do efeito background quando o uso do caldo Middlebrook 7H9 foi substituído por solução de cloreto de sódio 0,9% conferindo melhores ajustes lineares em 3, 24 e 48 horas e coeficiente de determinação (R2) de 0,99 em conformidade com a resolução Nº 899/2003 da ANVISA referente à validação de métodos bioanalíticos. A considerável redução do tempo de ensaio de 4 semanas para no máximo 48 horas, o relativo baixo custo, a facilidade de execução da técnica e os resultados obtidos são fortes incentivos à continuação dos estudos de validação e de correlação dos resultados de viabilidade do BCG fornecidos pela redução do XTT com àqueles obtidos pela técnica convencional de contagem de colônias em Lowenstein-Jensen.