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Title: Estudo das vias de sinalização envolvidas na apoptose induzida pelo complexo de rutênio com timina em células de carcinoma de cólon humano HCT116
Advisor: Bezerra, Daniel Pereira
Members of the board: Borges, Valéria de Matos
Lima, Flávia Oliveira de
Zanette, Dalila Lucíola
Authors: Silva, Suellen Leila Rocha
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract: O câncer se caracteriza pela proliferação descontrolada de células levando a formação de tumores que podem gerar metástase. Essa doença tornou-se um problema de saúde pública devido ao seu grande e crescente número de casos, além do alto impacto financeiro sobre a sociedade. Os quimioterápicos representam principal forma de tratamento; entretanto, apresentam diversos efeitos colaterais,além do surgimento de resistência, tornando necessário o desenvolvimento de novos fármacos. Recentemente, nosso grupo de pesquisa sintetizou um complexo de rutênio com timina [Ru(PPh3)2(Thy)(bipy)]PF6 (onde PPh = trifenilfosfino, Thy = timina and bipy = 2,2’-bipiridina) (CRT) com potente atividade citotóxica, capaz de ligar-se ao DNA e induzir a apoptose mediada por caspases em células de leucemia.OBJETIVO: Neste estudo, nós investigamos as vias de sinalização envolvidas na apoptose induzida pelo complexo Ru(II)-timina em células de carcinoma de cólon humano HCT116, bem como avaliamos seu efeito em modelo de xenotransplante. MATERIAL E MÉTODOS: Para verificar a participação das vias MAPKs e p53 na morte celular induzida por CRT, foi utilizado o ensaio de anexina V/PI em células HCT116 pré-tratadas com os inibidores farmacológicos de JNK (SP 600125), p38 (PD 169316), ERK1/2 (U-0126) e p53 (pifitrina-α cíclica), e quantificada a fluorecencia por citometria de fluxo. As MAPKs fosforiladas, bem como p53, MDM2 e histona H2AX foram avaliadas através de ELISA sanduiche fosfo-especifico. A atividade antitumoral in vivo foi avaliada em camundongos C.B-17 SCID transplantados com células HCT116 e tratados com CRT nas doses de 1 e 2 mg/kg/dia, por via intraperitoneal, uma vez por dia durante 15 dias consecutivos. RESULTADOS: O complexo Ru(II)-timina aumentou significativamente a porcentagem de células HCT116 em apoptose. O co-tratamento com os inibidores farmacológicos de JNK/SAPK, p38 MAPK e MEK, que inibem a ativação de ERK1/2,causou uma redução acentuada da porcentagem de células em apoptose induzida pelo complexo. Além disso, o CRT induziu um aumento de fosfo-JNK2 (T183/Y185),fosfo-p38α (T180/Y182) e fosfo-ERK1 (T202/Y204) em células HCT116. O tratamento com o complexo aumentou significativamente a expressão da fosfohistona H2AX (S139), um marcador de dano ao DNA. A expressão de fosfo-p53 (S15) e MDM2 não foi alterada, e o co-tratamento com o inibidor de p53 (pifitrina-α cíclico) não reduziu a apoptose induzida pelo CRT em células HCT116, indicando que o complexo Ru(II)-timina induz apoptose através de dano ao DNA, pela ativação da via de sinalização JNK/p38/ERK1/2 de maneira independente de p53. No modelo in vivo, o CRT (1 e 2 mg/kg/dia) apresentou inibição do crescimento de células HCT116 em 32,6-40,1%, e não apresentou toxicidade significativa nos parâmetros analisados. CONCLUSÃO: Assim, observou-se que o complexo Ru(II)-timina é um promissor candidato a agente antitumoral.
Abstract: Cancer is characterized by the uncontrolled proliferation of cells leading to the formation of tumors that can generate metastasis. This disease has become a public health problem due to its large and growing number of cases besides the high financial impact on society. Hemotherapeutic agents represent the main form of treatment; however, they present several side effects, besides the appearance of resistance, making necessary the development of new drugs. Recently, our research group synthesized a ruthenium complex with thymine [Ru (PPh3)2(Thy)(bipy)]PF6 (where PPh = triphenylphosphino, Thy = thymine and bipy = 2,2'-bipyridine) (CRT) with potent cytotoxic activity, with potential cytotoxic activity, capable of binding to DNA and inducing caspase-mediated apoptosis in leukemia cells. AIM: In this study, we investigated the signaling pathways involved in the Ru(II)-thymine complex-induced apoptosis in human colon carcinoma HCT116 cells, as well as its effect in a xenograft tumor model. MATERIAL AND METHODS: To verify the involvement of the MAPKs and p53 pathways in CRT-induced cell death, the annexin V/PI assay was performed on HCT116 cells pretreated with the pharmacological inhibitors of JNK (SP 600125), p38 (PD 169316), ERK1/2 (U-0126) and p53 (cyclic α-pifythrin), and quantified fluorometry by flow cytometry. Phosphorylated MAPKs as well as p53, MDM2 and histone H2AX were evaluated by phospho-specific ELISA sandwich. In vivo antitumor activity was evaluated in SCID C.B-17 mice transplanted with HCT116 cells and treated with CRT at doses of 1 and 2 mg/kg/day intraperitoneally once daily for 15 consecutive days. RESULTS: The Ru(II)-thymine complex significantly increased the percentage of HCT116 cells in apoptosis. Co-treatment with the pharmacological inhibitors of JNK/SAPK, p38 MAPK and MEK, which inhibit the activation of ERK1/2, caused a marked reduction in the percentage of cells in apoptosis induced by the complex. In addition, CRT induced an increase of phospho-JNK2 (T183/Y185), phospho-p38α (T180/Y182) and phospho-ERK1 (T202/Y204) in HCT116 cells. Treatment with the complex increased significantly the phosphohistone H2AX (S139) expression, a DNA damage marker. The expression of phospho-p53 (S15) and MDM2 were not changed, and the cotreatment with a p53 inhibitor (cyclic pifithrin-α) did not reduce the complex-induced apoptosis in HCT116 cells, indicating that the Ru(II)-hymine complex induces DNA damage mediated apoptosis by JNK/p38/ERK1/2 activation via a p53-independent signaling. In the in vivo model, CRT (1 and 2 mg/kg/day) showed inhibition of HCT116 cell growth in 32.6-40.1%, and showed no significant toxicity in the analyzed parameters. CONCLUSION:Thus, it has been observed that the Ru(II)-thymine complex is a promising candidate for antitumor agent.
Keywords: Ruthenium
Thymine
HCT116
MAPK
Cytotoxicity
Apoptosis
keywords: Rutênio
Timina
Células HCT116
Citotoxicidade
Apoptose
Issue Date: 2019
Publisher: Instituto Gonçalo Moniz
Citation: SILVA, Suellen Laila Rocha. Estudo das vias de sinalização envolvidas na apoptose induzida pelo complexo de rutênio com timina em células de carcinoma de cólon humano HCT116. 2019. 68 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa) – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, 2019.
Date of defense: 2019
Place of defense: Salvador/BA
Department: Coordenação de Ensino
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz
Program: Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
Copyright: open access
Appears in Collections:BA - IGM - Dissertações de Mestrado

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