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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33906
ESTUDO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDAS NA APOPTOSE INDUZIDA PELO COMPLEXO DE RUTÊNIO COM TIMINA EM CÉLULAS DE CARCINOMA DE CÓLON HUMANO HCT116
Silva, Suellen Leila Rocha | Date Issued:
2019
Author
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract in Portuguese
O câncer se caracteriza pela proliferação descontrolada de células
levando a formação de tumores que podem gerar metástase. Essa doença tornou-se um problema de saúde pública devido ao seu grande e crescente número de casos, além do alto impacto financeiro sobre a sociedade. Os quimioterápicos representam principal forma de tratamento; entretanto, apresentam diversos efeitos colaterais,além do surgimento de resistência, tornando necessário o desenvolvimento de novos fármacos. Recentemente, nosso grupo de pesquisa sintetizou um complexo de rutênio com timina [Ru(PPh3)2(Thy)(bipy)]PF6 (onde PPh = trifenilfosfino, Thy = timina and bipy = 2,2’-bipiridina) (CRT) com potente atividade citotóxica, capaz de ligar-se ao DNA e induzir a apoptose mediada por caspases em células de leucemia.OBJETIVO: Neste estudo, nós investigamos as vias de sinalização envolvidas na apoptose induzida pelo complexo Ru(II)-timina em células de carcinoma de cólon humano HCT116, bem como avaliamos seu efeito em modelo de xenotransplante. MATERIAL E MÉTODOS: Para verificar a participação das vias MAPKs e p53 na morte celular induzida por CRT, foi utilizado o ensaio de anexina V/PI em células HCT116 pré-tratadas com os inibidores farmacológicos de JNK (SP 600125), p38 (PD 169316), ERK1/2 (U-0126) e p53 (pifitrina-α cíclica), e quantificada a fluorecencia por citometria de fluxo. As MAPKs fosforiladas, bem como p53, MDM2 e histona H2AX foram avaliadas através de ELISA sanduiche fosfo-especifico. A atividade antitumoral in vivo foi avaliada em camundongos C.B-17 SCID transplantados com células HCT116 e tratados com CRT nas doses de 1 e 2 mg/kg/dia, por via intraperitoneal, uma vez por dia durante 15 dias consecutivos. RESULTADOS: O complexo Ru(II)-timina aumentou significativamente a porcentagem de células HCT116 em apoptose. O co-tratamento com os inibidores farmacológicos de JNK/SAPK, p38 MAPK e MEK, que inibem a ativação de ERK1/2,causou uma redução acentuada da porcentagem de células em apoptose induzida pelo complexo. Além disso, o CRT induziu um aumento de fosfo-JNK2 (T183/Y185),fosfo-p38α (T180/Y182) e fosfo-ERK1 (T202/Y204) em células HCT116. O tratamento com o complexo aumentou significativamente a expressão da fosfohistona H2AX (S139), um marcador de dano ao DNA. A expressão de fosfo-p53 (S15) e MDM2 não foi alterada, e o co-tratamento com o inibidor de p53 (pifitrina-α cíclico) não reduziu a apoptose induzida pelo CRT em células HCT116, indicando que o complexo Ru(II)-timina induz apoptose através de dano ao DNA, pela ativação da via de sinalização JNK/p38/ERK1/2 de maneira independente de p53. No modelo in vivo, o CRT (1 e 2 mg/kg/dia) apresentou inibição do crescimento de células HCT116 em 32,6-40,1%, e não apresentou toxicidade significativa nos parâmetros analisados. CONCLUSÃO: Assim, observou-se que o complexo Ru(II)-timina é um promissor candidato a agente antitumoral.
Abstract
Cancer is characterized by the uncontrolled proliferation of cells
leading to the formation of tumors that can generate metastasis. This disease has become a public health problem due to its large and growing number of cases besides the high financial impact on society. Hemotherapeutic agents represent the main form of treatment; however, they present several side effects, besides the appearance of resistance, making necessary the development of new drugs. Recently, our research group synthesized a ruthenium complex with thymine [Ru (PPh3)2(Thy)(bipy)]PF6 (where PPh = triphenylphosphino, Thy = thymine and bipy =
2,2'-bipyridine) (CRT) with potent cytotoxic activity, with potential cytotoxic activity, capable of binding to DNA and inducing caspase-mediated apoptosis in leukemia cells. AIM: In this study, we investigated the signaling pathways involved in the Ru(II)-thymine complex-induced apoptosis in human colon carcinoma HCT116 cells, as well as its effect in a xenograft tumor model. MATERIAL AND METHODS: To verify the involvement of the MAPKs and p53 pathways in CRT-induced cell death, the annexin V/PI assay was performed on HCT116 cells pretreated with the pharmacological inhibitors of JNK (SP 600125), p38 (PD 169316), ERK1/2 (U-0126) and p53 (cyclic α-pifythrin), and quantified fluorometry by flow cytometry. Phosphorylated MAPKs as well as p53, MDM2 and histone H2AX were evaluated by phospho-specific ELISA sandwich. In vivo antitumor activity was evaluated in SCID C.B-17 mice transplanted with HCT116 cells and treated with CRT at doses of 1 and 2 mg/kg/day intraperitoneally once daily for 15 consecutive days. RESULTS: The Ru(II)-thymine complex significantly increased the percentage of HCT116 cells in apoptosis. Co-treatment with the pharmacological inhibitors of JNK/SAPK, p38
MAPK and MEK, which inhibit the activation of ERK1/2, caused a marked reduction in the percentage of cells in apoptosis induced by the complex. In addition, CRT induced an increase of phospho-JNK2 (T183/Y185), phospho-p38α (T180/Y182) and phospho-ERK1 (T202/Y204) in HCT116 cells. Treatment with the complex increased significantly the phosphohistone H2AX (S139) expression, a DNA damage marker.
The expression of phospho-p53 (S15) and MDM2 were not changed, and the cotreatment with a p53 inhibitor (cyclic pifithrin-α) did not reduce the complex-induced apoptosis in HCT116 cells, indicating that the Ru(II)-hymine complex induces DNA damage mediated apoptosis by JNK/p38/ERK1/2 activation via a p53-independent signaling. In the in vivo model, CRT (1 and 2 mg/kg/day) showed inhibition of HCT116 cell growth in 32.6-40.1%, and showed no significant toxicity in the analyzed parameters. CONCLUSION:Thus, it has been observed that the Ru(II)-thymine complex is a promising candidate for antitumor agent.
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