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Title: Estudo do papel do gene TcRad51 na infecção por Trypanosoma cruzi
Advisor: Murta, Silvane Maria Fonseca
Machado, Carlos Renato
Members of the board: Murta, Silvane Maria Fonseca
Machado, Carlos Renato
Garcia, Camila Carrião Machado
Sá, Renata Guerra
Nahum, Laila Alves
Guarneri, Alessandra Aparecida
Authors: Santos, Selma da Silva
Coadvisor: Andrade, Luciana
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract: O gene TcRad51 apresenta uma importante função no reparo de quebras duplas no DNA, lesões oxidativas e na recombinação homóloga. Com o objetivo de investigar a importância da recombinação homóloga durante a infecção, parasitos mutantes foram gerados a partir do tipo selvagem clone CL Brener de Trypanosoma cruzi. Esses mutantes superexpressam o gene Rad51 (Rad51+) ou apresentam apenas uma cópia desse gene (heminocaute Rad51-/+). Formas tripomastigotas do tipo selvagem e parasitos mutantes foram utilizados em ensaios de infecção com o objetivo de estudar a invasão do parasito e replicação intracelular em fibroblastos embrionários murinos imortalizados e macrófagos humanos. O mutante que superexpressa Rad51 apresentou aumento da multiplicação intracelular após 48 e 96 horas de infecção quando comparado com células de tipo selvagem. Por outro lado, os mutantes heminocautes apresentam baixa multiplicação intracelular, quando comparado com os outros dois grupos. Em uma segunda etapa do projeto investigamos a infecção de fibroblastos murinos, com essas mesmas linhagens previamente expostas a 500 Gy de radiação gama. Após a radiação os parasitos conseguem infectar, no entanto, eles não conseguem completar o ciclo celular dentro dos fibroblastos nas primeiras 96h após a infecção. O acompanhamento da infecção com as culturas irradiadas revelou que o primeiro grupo a apresentar as formas tripomastigotas no sobrenadante foi a cultura infectada com cepas TcRad51+, depois de alguns dias, apareceu no WT e com mais alguns dias, na infecção com a cepa Rad51-/+. No estudo da epimastigogênese após a radiação gama, obtivemos um resultado semelhante ao experimento anterior, o primeiro grupo após incubação com LIT a aparecer foi formas epimastigotas de TcRad51+, e depois de alguns dias, essas formas foram observadas nos outros grupos. Nos experimentos “in vivo” foi observado um atraso, no pico de parasitemia do superexpressor de Rad51, mas este foi mais alto, quando comparado com o WT. No Rad51-/+ não foi observado um pico de parasitemia definido, e este se manteve baixo por todo o período de acompanhamento. A porcentagem de cura dos animais infectados com WT e TcRad51-/+ tratados com Benzonidazol (BZ) foi alta (>85%), enquanto naqueles infectados com TcRad51+ foi de apenas 50%. Estes resultados indicam que a proteína Rad51 e a recombinação homóloga exercem uma função relevante no processo de infecção in vitro e in vivo do T. cruzi.
Abstract: The TcRad51 gene has an important role in the repair of DNA double- strand breaks (DSB), oxidative lesions and in the homologous recombination. In order to investigate the importance of homologous recombination during Trypanosoma cruzi infection, mutant parasites were generated from the wild- type T. cruzi CL Brener clone. These mutants overexpress the Rad51 gene (Rad51+) or they have only one Rad51 gene copy (hemiKnockout -/+ Rad51). Wild-type and mutants parasites trypomastigotes forms were used in infection assays to investigate parasite invasion and intracellular replication into immortalized murine embryonic fibroblasts and macrophages. The mutant that overexpressed Rad51 had an increase in intracellular multiplication after 48 and 96 hours of infection when compared with wild-type cells. On the other hand, the hemiknockout mutant -/+ present low intracellular multiplication compared to other two groups. In a second part of this project, we investigated the T. cruzi infection in murine fibroblasts, with these same parasite lines exposed to 500 Gy gamma radiation. After radiation, the parasites are able to infect, however, they are not able to complete the cell cycle inside of the fibroblasts 96h after infection. The follow-up of the cultures infected with irradiated parasites, showed that the TcRad51+ mutant was the first group to present trypomastigote forms in the supernatant , after few days appeared parasites in WT-infected cultures and after that appeared parasites in the Rad51-/+ infected cultures. In epimastigogenesis analysis after gamma radiation, we obtained a similar result to experiment described above, the first group after LIT incubation to appear epimastigote forms was the TcRad51+ mutant, and after a few days these forms were also observed in the other groups. The "in vivo" experiments were observed a delay in the parasitemia peak of the Rad51 overexpressor parasites, but this peak was higher than that observed to the WT. In Rad51-/+ mutant was not observed a defined parasitemia peak, and this peak remained low along all period evaluated. The percentage of cure of the animals infected with WT and TcRad51-/+ and treated with benznidazole (BZ) was high (> 85%), while in the infected mice with TcRad51+ mutant was only 50%. These results indicate that the RAD51 protein and the homologous recombination have relevant function in the in vitro and in vivo T. cruzi infection process.
Keywords: Infection
Trypanosoma cruzi
Recombination
keywords: Infecção
Trypanosoma cruzi
Recombinação
DeCS: Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi
Recombinação Genética
Issue Date: 2018
Citation: SANTOS, Selma Silva. Estudo do papel do gene TcRad51 na infecção por Trypanosoma cruzi. 2018. 128 f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde)-Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2018.
Date of defense: 2018
Place of defense: Belo Horizonte/MG
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil
Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, Brasil
Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto, MG, Brasil
Program: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:MG - IRR - PPGCS - Teses de Doutorado

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