Estudo do papel do gene TcRad51 na infecção por Trypanosoma cruzi

Abstract

O gene TcRad51 apresenta uma importante função no reparo de quebras duplas no DNA, lesões oxidativas e na recombinação homóloga. Com o objetivo de investigar a importância da recombinação homóloga durante a infecção, parasitos mutantes foram gerados a partir do tipo selvagem clone CL Brener de Trypanosoma cruzi. Esses mutantes superexpressam o gene Rad51 (Rad51+) ou apresentam apenas uma cópia desse gene (heminocaute Rad51-/+). Formas tripomastigotas do tipo selvagem e parasitos mutantes foram utilizados em ensaios de infecção com o objetivo de estudar a invasão do parasito e replicação intracelular em fibroblastos embrionários murinos imortalizados e macrófagos humanos. O mutante que superexpressa Rad51 apresentou aumento da multiplicação intracelular após 48 e 96 horas de infecção quando comparado com células de tipo selvagem. Por outro lado, os mutantes heminocautes apresentam baixa multiplicação intracelular, quando comparado com os outros dois grupos. Em uma segunda etapa do projeto investigamos a infecção de fibroblastos murinos, com essas mesmas linhagens previamente expostas a 500 Gy de radiação gama. Após a radiação os parasitos conseguem infectar, no entanto, eles não conseguem completar o ciclo celular dentro dos fibroblastos nas primeiras 96h após a infecção. O acompanhamento da infecção com as culturas irradiadas revelou que o primeiro grupo a apresentar as formas tripomastigotas no sobrenadante foi a cultura infectada com cepas TcRad51+, depois de alguns dias, apareceu no WT e com mais alguns dias, na infecção com a cepa Rad51-/+. No estudo da epimastigogênese após a radiação gama, obtivemos um resultado semelhante ao experimento anterior, o primeiro grupo após incubação com LIT a aparecer foi formas epimastigotas de TcRad51+, e depois de alguns dias, essas formas foram observadas nos outros grupos. Nos experimentos “in vivo” foi observado um atraso, no pico de parasitemia do superexpressor de Rad51, mas este foi mais alto, quando comparado com o WT. No Rad51-/+ não foi observado um pico de parasitemia definido, e este se manteve baixo por todo o período de acompanhamento. A porcentagem de cura dos animais infectados com WT e TcRad51-/+ tratados com Benzonidazol (BZ) foi alta (>85%), enquanto naqueles infectados com TcRad51+ foi de apenas 50%. Estes resultados indicam que a proteína Rad51 e a recombinação homóloga exercem uma função relevante no processo de infecção in vitro e in vivo do T. cruzi.