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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/34377
AVALIAÇÃO DE MODELOS MURINOS UTILIZANDO CAMUNDONGOS IMUNOCOMPETENTES E VÍRUS NÃO ADAPTADOS PARA O ESTUDO DA DENGUE
Santos, Beatriz Senra Álvares da Silva | Date Issued:
2018
Advisor
Co-advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract in Portuguese
RESUMO: Existem vários modelos murinos para estudar dengue. Alguns deles utilizam camundongos imunologicamente deficientes ou humanizados, enquanto outros grupos utilizam vírus modificados. Nosso grupo relatou anteriormente um inoculo intracraniano de DENV altamente virulento em camundongos imunologicamente competentes (C57BL/6), causando a morte dos camundongos. A infecção intracraniana realizada no presente trabalho teve o intuito de comparar a perda de peso ocorrida com este tipo de infecção previamente descrita com a perda de peso obtida após a inoculação subcutânea, utilizando a mesma amostra de camundongos e o mesmo vírus altamente virulento. Neste trabalho, apresentamos um modelo com os mesmos camundongos C57BL/6 usados anteriormente, infectados por via subcutânea com DENV altamente virulento.Neste modelo murino de inoculo subcutâneo, os níveis de citocinas, o hemograma e a produção de óxido nítrico, juntamente com a medida da perda de peso e de mortalidade, foram utilizados para a
comparação dos animais infectados em relação aos não infectados, permitindo uma melhor compreensão da doença. Os camundongos foram inoculados pela via intracraniana ou subcutânea e avaliados pelos sinais clínicos da dengue. O hemograma foi realizado pela coloração panótica nos leucócitos para a contagem diferencial e contagem total de leucócitos,
hemácias e plaquetas foram realizadas em câmara de Neubauer. As itocina
s foram medidas por citometria de fluxo e PCR quantitativa (qPCR). O óxido
nítrico foi medido pela reação de Griess após exposição de macrófagos murinos ao virus. Os camundongos infectados com DENV subcutaneamente apresentaram perda de peso, mas não apresentaram nenhum outro sinal clínico. Embora o número de hemácias não tenha sido diferente entre camundongos infectados e não infectados nos camundongos por via subcutanea, o número de leucócitos e de plaquetas diminuiu após a infecção. As citocinas TNF alfa e IFN gama aumentaram após a infecção subcutanea. A infecção subcutânea protegeu os camundongos de uma segunda infecção com o vírus por via intracraniana. A titulação viral no cérebro após a infecção intracraniana ou a soro-neutralização após a infecção subcutânea foram realizadas para confirmar a infecção dos camundongos. Também estudamos um modelo de infecção utilizando a picada do mosquito (previamente infectado com DENV) em camudongos. O resultado neste modelo foi um aumento da expressão de nos2 no cérebro dos camundongos infectados através desta picada de Aedes aegypti infectados. Foi observada também uma maior produção de óxido nítrico ex vivo nos macrófagos de C57BL/6, quando estimulados com DENV, em comparação com a produção em macrófagos não estimulados. Concluindo, o modelo subcutâneo
apresentado neste trabalho tem suas limitações, como todos os outros modelos já mencionados na literatura, mas é um novo modelo, que usa camundongos imunologicamente competentes, sendo infectados pela via subcutânea com um DENV altamente infeccioso, resultando em alterações no peso, produção de IFN gama e TNF alfa e diminuição do número das plaquetas. Este modelo subcutâneo apresentado é um modelo adicional interessante para o estudo da resposta imune contra dengue.
Abstract
Various mouse models to study dengue have been described by different
authors, some of them using immunodeficient or some using humanized mice. Our group reported previously a deadly murine model, which used the intracranial inoculum of highly virulent Dengue virus (DENV) in immune competent mouse. Here we present a model of immune competent mouse (C57BL/6), infected subcutaneously by the same highly virulent DENV (DENV3 genotype I). In this immunocompetent systemic mice model, the cytokine levels and hematological parameters such as total and differential leukocyte and platelets counts, together with weight loss, were considered important monitoring parameters, allowing a better understanding of the systemic human disease. Mice were inoculated subcutaneously and evaluated by the percentage weight variation as well as the clinical signs. The hemogram was performed by the panoptic coloration of the leukocytes for the differential count and the total counts of leukocytes, red cells and platelets were performed in Neubauer's chamber. Cytokines were measured by flow cytometry and quantitative PCR (qPCR). Nitric oxide was measured by the Griess reaction after exposure of murine macrophages to the virus. Hematological parameters and cytokines levels were measured and viral titration in brain tissue or serum neutralization were performed to confirm mice infection. The subcutaneously
DENV inoculated mice showed weight loss after infection, but they did not show any other clinical signs. Although the number of red cells was not different between infected and uninfected mice in the infected subcutaneous mice, the number of leukocytes and platelets decreased after infection. The leukocytes and platelets decreased after subcutaneous inoculation. The cytokines TNF alpha and IFN gamma increased after infection in mice. We also studied a model of infection using the mosquito bite (previously infected with DENV) in mice. The result in this model was an increase in nos2 expression in the brain of infected mice through this infected Aedes aegypti bite. A higher production of ex vivo nitric oxide was also observed in the C57BL/6 macrophages when stimulated with DENV compared to the production in unstimulated macrophages. The subcutaneous model provided scope for improved understanding of the dengue pathogenesis, as well as possible mechanism for protection to subsequent mouse infected by intracranial route in mice. This model could be used to study the vertebrate immune response and evaluation of drugs or vaccine against dengue virus.
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