A reação em Cadeia da Polimerase como técnica auxiliar no diagnóstico de malária em serviços de saúde de referencia em Minas Gerais

Abstract

O diagnóstico de rotina para malária humana continua sendo um desafio para os laboratórios dos países onde a doença é endêmica. Nestas áreas, o diagnóstico de rotina continua sendo a microscopia óptica (MO), que apesar de sua relativa simplicidade e baixo custo, depende de um microscopista bem treinado. Diante desta limitação, a partir da década de 90, muitos protocolos baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) têm sido publicados, o que tem permitido a identificação e caracterização das espécies de plasmódios. O grande impacto da PCR tem sido, principalmente, em estudos epidemiológicos, pela possibilidade de detectar parasitas abaixo do limite de detecção da MO. Entretanto, poucos estudos têm validado a PCR em laboratórios de referência de países endêmicos, onde os microscopistas são capazes de detectar parasitemias tão baixas quanto 5 parasitas/μL de sangue. Diante disso, propôs-se, no presente trabalho, avaliar a técnica de PCR como ferramenta auxiliar no diagnóstico de malária em Serviços de Saúde de referência para o diagnóstico laboratorial de malária em Minas Gerais. Inicialmente, o desempenho de duas técnicas moleculares, a Nested-PCR e a PCR em Tempo Real, foi avaliado em 94 amostras de campo. Os resultados permitiram concluir que não houve diferença estatisticamente significativa entre a Nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Além disso, para simplificar a coleta das amostras, foram comparadas extrações a partir de sangue total e sangue em papel de filtro, com volumes de 30 e 60μL de sangue em papel (n=70). Não houve diferença entre a PCR realizada com amostras de sangue total ou em papel de filtro. De relevância, todos os protocolos de PCR apresentaram limitações para detectar parasitemias abaixo de 100 parasitas/μL de sangue. Estes resultados, embora aparentemente contraditórios com a literatura, estão de acordo com os poucos estudos que avaliaram em amostras de campo a sensibilidade da PCR em função da densidade parasitária. De fato, em diversos protocolos a detecção da PCR é de <1 parasita/ μL de sangue, porém tal detecção tem sido baseada em amostras de DNA obtidas a partir de parasitos em cultura ou DNA plasmidial. Apesar destas limitações, em uma próxima etapa, optou-se por avaliar a técnica de PCR nos serviços de saúde dos municípios de Belo Horizonte e Uberlândia, no período de fevereiro a novembro de 2009. Neste período, 70 indivíduos com suspeita de infecção malárica procuraram os serviços, sendo 22 deles diagnosticados como positivos pela microscopia óptica. Em todos os indivíduos, positivos e negativos, os resultados da PCR concordaram com a MO, inclusive em relação à espécie de plasmódio. Neste grupo, as baixas parasitemias não foram freqüentes já que os pacientes que procuraram o serviço apresentavam altas parasitemias (>300 parasitas/μL de sangue). Para a maior parte dos indivíduos que retornaram aos serviços para verificação da cura parasitológica (11/13), a PCR concordou com a MO, sendo que em dois deles, a PCR permaneceu positiva enquanto a MO já havia negativado. Pode-se concluir que a PCR tem limitações para detecção de baixas parasitemias e recomenda-se cautela ao se estabelecer a PCR como ferramenta diagnóstica, já que a amplificação do DNA pode não significar doença clínica.