Caracterização de α-glicosidases de Lutzomyia longipalpis: atividades enzimáticas, expressão gênica e modulação por Leishmania mexicana

Abstract

Lutzomyia longipalpis é o vetor de Leishmania infantum, um dos agentes causadores da leishmaniose visceral. Os flebotomíneos adultos possuem uma dieta rica em açúcares, essencial para atender às demandas energéticas necessárias ao desenvolvimento; as fêmeas, além de açúcares, também se alimentam de sangue. As α-glicosidases e α-amilases estão envolvidas na digestão de carboidratos adquiridos na dieta, e são classificadas nas famílias 13 e 31 das glicosídeo hidrolases. Para determinação da atividade de α-glicosidase utilizando o substrato MUαGlu padronizamos uma técnica de ensaio contínuo para realização de ensaios em amostras teciduais individuais. Quantificamos a atividade de α-glicosidase em diferentes tecidos, ressaltando a atividade presente no divertículo e no intestino médio de L. longipalpis, sendo essa enzima mais ativa sobre sacarose que sobre o substrato MUαGlu. Atividades basais foram observadas em insetos não alimentados; a alimentação sanguínea induz a atividade no conteúdo do intestino médio e a alimentação açucarada modula a atividade nos tecidos do intestino médio. A exposição a diferentes concentrações ou moléculas de açúcares também alterou a atividade. As α-glicosidases de diferentes tecidos apresentaram diferentes propriedades bioquímicas, como pH ótimo entre 7,0 - 8,0, KM entre 0,37 - 4,7 mM (MUαGlu como substrato), pH ótimo de 6,0 e KM entre 11 - 800 mM (sacarose como substrato) Enzimas do divertículo e do tecido do intestino médio apresentaram inibição em altas concentrações de substrato (sacarose), o que explica os altos valores de KM encontrados. No genoma de L. longipalpis foram encontradas nas famílias GH13 e GH31 proteínas envolvidas no metabolismo de açúcar, transporte de aminoácidos, armazenamento e mobilização das reservas de glicogênio e regulação da miogênese. Descrevemos também uma α-glicosidase neutra (controle de N-glicosilação) e uma α-glicosidase lisossomal inativa (sem resíduos catalícos). A estrutura e as funções dessas proteínas identificadas são conservadas. Uma análise comparativa demonstrou retração no número de genes de maltases e expansão das α-amilases, com organização em dois grandes clusters. Maltases são mais expressas no intestino médio de fêmeas alimentadas com sangue, e a infecção por L. mexicana modulou negativamente a sua expressão gênica. Em fêmeas alimentadas com sangue (sem sacarose), as taxas de infecção por L. mexicana e migração para a região da cárdia não foram afetadas, sugerindo que a migração não é inteiramente baseada nos estímulos de quimiotaxia pelas moléculas de açúcar. Contudo, a ausência de açúcar na dieta do inseto resultou no desenvolvimento de L. mexicana no intestino posterior. Todos esses resultados sugerem que as α-amilases evoluíram para assumir diferentes funções além da hidrólise de açúcares primários e que as α-glicosidases também estão envolvidas em diferentes processos metabólicos, como digestão de açúcares vegetais, digestão de glicoproteínas ou glicolipídios sanguíneos e mobilização de estoques energéticos.