Detecção de polimorfismos de base única em etiquetas de seqüências expressas de Schistosoma mansoni

Abstract

A aplicação de marcadores moleculares tem sido útil na investigação genética de parasitos de importância médica e seus hospedeiros. A correlação de tipos genéticos com dados clínicos tem sido realizada com o uso de marcadores moleculares polimórficos. Marcadores tipo SNPs (polimorfismos de base única) são o tipo mais comum de variação de seqüência encontrados em eucariotas. Sabe-se que os SNPs são marcadores dialélicos altamente estáveis, cuja estimativa de freqüência pode ser realizada com relativa facilidade. Não obstante, até o presente trabalho, SNPs não foram descritos em larga escala no parasito Schistosoma mansoni. Nesse contexto, nosso principal objetivo foi identificar polimorfismos de base única em etiquetas de sequências expressas (ESTs) de S. mansoni. As 61.002 ESTs utilizadas na detecção de SNPs foram geradas pela Rede Genoma de Minas Gerais, através da técnica de sequenciamento parcial de cDNAs. As sequências foram processadas por um sistema automatizado que foi desenvolvido a partir do uso de programas públicos (PHRED/CROSS_MATCH/PHRAP/CONSED) e um novo programa de busca por SNPs, cSNPer. O cSNPer foi escrito na linguagem C pelo nosso grupo e identifica polimorfismos em arquivos do tipo .ace gerados por programas de agrupamento, como o Phrap, e analisa a conseqüência da mutação para a proteína codificada. Foram identificados 2.303 possíveis SNPs em 863 agrupamentos, sendo utilizado o valor de qualidade nas ESTs de Phred ≥ 20, na seqüência consenso de Phred ≥ 40 e nas bases vizinhas de Phred ≥ 15. Foi analisada a presença de SNPs em genes candidatos à vacina, nas quais Sm14, Sm23, catepsina B e GST apresentaram-se polimórficos. Em seguida, foi realizada a validação da presença de SNPs no gene da catepsina B. A catepsina B é responsável por degradar hemoglobina presente no sangue do hospedeiro humano, que é a principal fonte de nutrição do Schistosoma. Foi identificada a presença de 16 SNPs na seqüência da catepsina B, sendo que 6 resultaram na mudança do aminoácido codificado. Com o propósito de verificar se a presença dessas mutações não-sinônimas poderiam estar modificando a estrutura da proteína e, possivelmente, alterando a sua função, foi realizada a modelagem por homologia da catepsina B do parasito, utilizando o programa Modeller. As análises dos aminoácidos na estrutura modelo e na estrutura mutante foram realizadas utilizando o programa STING. Foi observado que as mudanças de aminoácido encontradas, provavelmente, não alteram a estrutura da proteína e, conseqüentemente, a sua função.