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Title: Contribuição ao estudo da diversidade do HIV-1 no Brasil: caracterização genotípica e fenotípica de amostras de HIV-1 obtidas em diferentes regiões geográficas
Advisor: Castro filho, Bernardo Galvão
Members of the board: Bongertz, Vera
Sabino, Ester Cerdeira
Bastos, Francisco Inácio
Tanuri, Amilcar
Brígido, Luís
Authors: Fernandez, José Carlos Couto
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Desde o estabelecimento em cultura do primeiro isolado de HIV-l no Brasil (Galvão-Castro e cols., 1987), já podíamos perceber um polimorfismo genético e biológico em amostras obtidas no início da epidemia de AIDS no país, indicando que esta heterogeneidade seria similar a descrita para o HIV-l em outras partes do mundo (Couto-Fernandez e cols., 1992). Nos anos subsequentes, buscando um melhor detalhamento da estrutura genética destes isolados, entre outros, sequenciamos um fragmento genômico de aproximadamente 860pb correspondentes as regiões V3, V4, V5 e parte da gp41 do envelope viral de 6 amostras coletadas entre 1987 e 1989 (documento 1). A análise filo genética mostrou que estas amostras brasileiras eram do subtipo B, com níveis de diversidade variando entre 5,9 e 13, 1%. A análise das seqüências de aminoácidos da alça V3 revelou que 3 amostras possuíam o motivo GPGR no topo da alça, característico de isolados Norte Americanos/Europeus, enquanto que nas outras três existia uma substituição da prolina pelo triptofano (W), metionina (M) e fenilalalina (F), respectivamente. O grau de diversidade antigênica, avaliado pela reatividade sorológica de 114 soros obtidos de pacientes do Rio de Janeiro, coletados no período de 1990 a 1992, frente à diferentes peptídeos sintéticos subtipo-específicos, mostrou que 60,5% deles reagiram com peptídeos do subtipo B e 15,8% mostraram reatividade específica para o peptídeo Bra-cons (GWG). Um elevado percentual de soros (37,7%) não mostrou reatividade com os diferentes peptídeos usados. Buscando conhecer o espectro da diversidade do HIV-1 nos sítios selecionados para futuros testes de vacinas anti-HIV/AIDS, foi estabelecida a Rede Nacional de Laboratórios para Isolamento e Caracterização do HIV-1 no Brasil que, permitiu uma análise abrangente e sistematizada de amostras coletadas em diferentes regiões do país. Estes estudos, realizados primeiramente em amostras do Rio de Janeiro (documento 2) e, subseqüentemente, de forma mais detalhada em amostras provenientes de três grandes cidades brasileiras (São Paulo, Rio de Janeiro e Belo Horizonte), permitiu a identificação de três subtipos genéticos do HIV-1, na proporção de 82,9% das amostras do subtipo B, 14,3% subtipo F e 2,9% subtipo C (documento 3). A variante B" foi identificada em 45% das amostras do subtipo B. A análise filo genética de 25 isolados virais utilizando seqüências genômicas correspondentes a região C2V3 do envelope viral, mostrou 100% de concordância com os resultados da análise da mobilidade de heteroduplexes - HMA. Não foi observada associação significativa entre os diferentes subtipos genéticos e propriedades biológicas in vitro. Confirmando dados anteriores, não foi demonstrada associação entre subtipos genéticos e perfis de soro-reatividade frente a peptídeos subtipo-específicos ou neutralização heteróloga. Reconhecendo a existência de lacunas no conhecimento sobre os níveis de diversidade do HIV-1 em outras regiões do Brasil, fora do eixo Rio - São Paulo, realizamos a subtipagem genética do HIV-1 em amostras obtidas de diferentes populações de risco na cidade de Salvador-Bahia (documento 4) que, atualmente, concentra o segundo maior número de casos de AIDS na região nordeste. Neste estudo foram analisadas amostras de usuários de drogas injetáveis (UDI) e de indivíduos infectados por via sexual. No grupo dos UDI, 89,5% das amostras foram classificadas como subtipo B, 3% subtipo F e 7,5% mostrou um perfil B/F na análise pelo HMA. No grupo de transmissão sexual, 95% das amostras eram do subtipo B, 3,4% mostrou um perfil B/F e uma amostra o perfil B/C/E no líM A. O sequenciamento genômico das amostras com múltiplos perfis no HMA permitiu classificá-las filogenéticamente como sendo do subtipo B, enquanto que as amostras do subtipo F, se agruparam com amostras brasileiras referência do mesmo subtipo. A análise da reatividade sorológica frente á diferentes peptídeos sintéticos subtipo-específico mostrou níveis elevados de reatividade cruzada entre os diferentes peptídeos, não permitindo a discriminação sorológica dos diferentes subtipos do HIV-1 no Brasil, bem como da variante B”. Ainda no referido estudo, não pudemos verificar associação entre os subtipos de HIV-1 e via de transmissão, sexo ou fator racial. Estimativas do Programa de AIDS das Nações Unidas (1999) calculam que nos próximos anos, vírus do subtipo não-B serão os principais responsáveis pelo surgimento de novos casos de AIDS, principalmente nos países em desenvolvimento. Neste contexto, buscando obter informações detalhadas sobre a estrutura molecular de vírus não-B circulante no Brasil, realizamos o sequenciamento molecular de uma amostra do subtipo D, recentemente identificada no Rio de Janeiro. A análise das sequências de nucleotídeos da amostra D brasileira mostrou estreita relação filogenética com isolados africanos do mesmo subtipo (documento 5). Os resíduos de cisteínas se mostraram relativamente conservados, novos sítios de glicosilação e uma grande inserção foi detectada na região V1/V2 do envelope virai, enquanto que o domínio GPGQ estava presente no topo da alça V3. Nenhum evento de recombinação foi verificado no envelope e genes acessórios, contudo, a porção 5 'do gene nef mostrou relação filogenética com vírus do subtipo B. Concluindo, realizamos um estudo comparativo dos níveis de diversidade da região V3 das amostras de HIV-1 incluídas neste estudo, procurando determinar o envolvimento de substituições de aminoácidos básicos, bem como da distribuição de cargas nesta região, como determinante do fenótipo/tropismo virai (documento 6). Aparentemente, a variabilidade da região V3 não implicou em alteração significativa da sua estrutura espacial. Apesar de não existir diferença significativa da carga total, ponto isoelétrico (pl) e percentual de aminoácidos básicos da região V3, pudemos detectar uma maior concentração de cargas positivas nos isolados T-linfotrópicos, indutores de sincício. Não houve correlação dos parâmetros acima analisados com subtipo genético do HIV-1, fenótipo biológico ou distribuição geográfica.
Abstract: Since the first isolation of a Brazilian HIV-1 strain (Galvão-Castro e cols., 1987) a genetic and biologic polymorphism of HIV-1 samples obtained at beginning of AIDS epidemic in Brazil was evident. Similar to that described for HIV-1 in other regions of the world (Couto-Fernandez e cols., 1992). Subsequently, to better know the genomic structure of this and other isolates, we sequenced a 860-base pair envelope fragment including V3, V4, V5, and the beginning of gp41 of six Brazilian HIV-1 strains, isolated between 1987 and 1989. The phylogenetic analysis classified all Brazilian samples as genotype B, with interhost distances between 5.9 and 13,1%. The amino acid sequence analysis of the V3 loops revealed that three strains contained the North American/European GPGR motif at the top of the loop whereas in the other three strains proline (P) was substituted by tryptophan (W), methionine (M), or phenylalanine (F), respectively. The antigenic diversity was analyzed through the serological reactivity of 114 sera of HIV-1 infected patients from Rio de Janeiro (1990/1992), against subtype-specific HIV-1 synthetic peptides. Sixty-nine sera (60.5%) reacted with peptides belonging to genotype B and 15,8% had biding antibodies to the Bra-cons (GWG) peptide. A high number of sera (37,7%) had no antibodies to any of the V3 peptides tested. To better understand the spectrum of HIV-1 diversity in three potential HIV vaccine sites in Brazil, was established the Brazilian Network for HIV isolation and Characterization for a systematic surveillance of HIV variability in different geographic regions. These studies were first performed in HIV-1 samples obtained from patients from Rio de Janeiro (document 2) and, subsequently more detailed analysis of isolates from three big Brazilian cities (São Paulo, Rio de Janeiro and Minas Gerais), revealed the presence of three genetic subtypes of HIV-1 identified by HMA: B (in 82,9% of the samples), F (14,3%) and C (2,9%) [document 3]. The HIV-1 B” variant was identified in 45% of subtype B samples. Phylogenetic analysis based on the C2V3/e«v DNA sequence from all 25 specimens examined was 100% concordant with the heteroduplex mobility assay -HMA results. No significant association was found between HIV-1 subtypes and the mode of transmission or biological properties of the HIV-1 isolates. Consistent with previous results, no relationship between viral subtype and peptide ELISA seroreactivity or neutralization was evidenced To expand the analysis to regions not belonging to the southeast Brazilian region, we investigated the distribution o f HIV-1 genetic subtypes in different populations from Salvador - Bahia (document 4), where the second major concentration o f AIDS cases from the northeast Brazil is found nowdays. Blood samples from HIV-1 seropositive injecting drug users (UDIs) and individuals infected sexually were analyzed using HMA. In the IDU group, 89,5% were classified as subtype B, 3% as subtype F, and 7,5% showed a B/F HMA profile. In the sexual transmission (ST) group, 95% were identified as B subtype, 3,4% showed a B/F profile, and 1,6% a B/C/E HMA profile. All Brazilian samples that showed multiple reactivities in HM A analysis clustered on sequencing with North American/European HIV-1 B subtype isolates in the phylogenetic analysis, whereas the F subtypes clustered with F Brazilian HIV-1 isolates. Serologic reactivities o f IDU’s sera were examined using a panel o f synthetic V3 loop peptides representative of the different HIV-1 subtypes. A high level o f cross-reactivity was observed against the different peptides, not permitting the serologic HIV-1 typing o f the genetic subtypes circulating in Brazil, even the B” variant. No difference in the serologic reactivity between F and B subtype plasma could be observed. In this study, no significant association was found between HIV-1 subtypes and the mode of transmission. For the coming decades the AIDS Program o f the United Nations (UNAIDS, 1999) estimates that non-B subtypes o f HIV-1 will be responsible for the majority o f new AIDS cases in developing countries. In this context, we genetically characterized a novel HIV-1 subtype D strain recently identified in Rio de Janeiro, Brazil. The nucleotide sequence of the Brazilian subtype D clearly grouped with African H IV-1 viruses from the same subtype (document 5). The cysteine residues were relatively well conserved, new glycosilation sites and a big insertion was detected in the V W 2 envelope region. However, the V3 diplayed the characteristic GPGQ motif in the top. No recombinant events were observed in the viral envelope and accessory genes. However, the 5’ region of the nef gene appears to be closer to subtype B sequences. In conclusion, in order to evaluate the molecular diversity in the envelope V3 region of the Brazilian HIV-1 strains included in this study, we analyzed the patterns of amino acid substitutions o f NSI-like and Sl-like isolate sequences to verify the involvement of basic amino acid substitutions, as well as the distribution o f charges in this region, as predictor of viral phenotype/tropism (document 6). Apparently, the V3 region diversity was not implied in significant changes in its spatial structure. Although no significant differences in the total charges, isoelectric points (pi) and percentages of basic ammo acids in the V3 region o f Brazilian strains, a higher concentration of positive charges in Tlymphotropic syncytium inducing isolates, could be detected. No correlation was observed between the parameters analyzed and HIV-1 genetic subtype, biologic phenotype or geographic distribution.
Keywords: HIV-1
Acquired Immunodeficiency Syndrome
Genetic Variation
Peptides
Serotyping
AIDS Vaccines
keywords: HIV-1
Síndrome de Imunodeficiência Adquirida
Variação Genética
Peptídeos
Sorotipagem
Vacina contra AIDS
Issue Date: 2000
Publisher: Instituto Oswaldo Cruz
Citation: FERNANDEZ, José Carlos Couto. Contribuição ao estudo da diversidade do HIV-1 no Brasil: caracterização genotípica e fenotípica de amostras de HIV-1 obtidas em diferentes regiões geográficas. 2000. 222 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz. Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2000.
Date of defense: 2000
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Defense institution: Instituto Oswaldo Cruz
Program: Pós-Praduação em Biologia Celular e Molecular
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBCM - Teses de Doutorado

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