Caracterização dos genes que codificam a enzima dihidrolipomida desidrogenase (TcLip DH) e a proteína transportadora de hexoses (TcrHT1) em cepas do Trypanosoma Cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol

Abstract

A glicose e outras hexoses são importantes para o funcionamento das células eucariotas. Os transportadores de hexoses são proteínas transmembrana que levam o substrato para dentro da célula. Na glicólise, o açúcar captado é convertido em piruvato e este, por sua vez, é convertido a acetil-CoA para o ciclo do ácido cítrico. A conversão do piruvato a acetil-CoA conta com a participação da enzima lipoamida desidrogenase (LipDH), uma flavoenzima homodimérica da família das FADdissulfeto oxiredutase que é também importante para o mecanismo de oxiredução da célula. Murta et al. (2008, in press), utilizando a metodologia Differential Display (DD) selecionaram os genes que codificam o transportador de hexoses (TcrHT1) e a enzima lipoamida desidrogenase (TcLipDH) como genes mais expressos em uma cepa do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol BZ e, que, portanto, seriam alvos em potencial para quimioterapia. Neste estudo, a fim de caracterizar os genes TcrHT1 e TcLipDH, foram analisados os níveis de mRNA; a organização genômica, a amplificação e a presença de polimorfismos; o nível de expressão ou atividade da proteína e a localização cromossômica em cepas do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. Ensaios de Northern blot e PCR em Tempo Real confirmaram os resultados de DD e mostraram que ambos estão cerca de 2X mais expressos na cepa com resistência induzida in vitro ao BZ, 17LER, quando comparada a seu par sensível, 17WTS. Por Southern blot confirmamos que o gene TcLipDH possui duas cópias e o TcrHT1, um arranjo em “tandem” e não estão amplificados no genoma de nenhuma cepa resistente. Além disso, foi encontrado um polimorfismo para o gene TcrHT1 que não está relacionado ao fenótipo de resistência a drogas e sim com o zimodema ao qual as cepas analisadas pertencem. Os resultados de Western blot mostraram que a enzima TcLipDH está igualmente expressa em todas as cepas analisadas à exceção da cepa 17LER na qual a proteína está 2X menos expressa em comparação à 17WTS. Devido à dificuldade de obter anticorpos anti-TcrHT1, os ensaios de Western blotting foram substituídos pelo ensaio de atividade enzimática no qual constatamos que a eficiência de captação de glicose é 40% menor na cepa 17LER quando comparada à 17WTS. A localização cromossômica desses genes não está relacionada à resistência e é zimodema dependente para o gene TcrHT1. Análises de bioinformática permitiram contextualizar evolutivamente ambos os genes e geraram informações interessantes sobre filogenia e anotação no genoma.