Mecanismos de ativação de neutrófilos infectados por Leishmania infantum: papel do heme e do lipofosfoglicano(LPG)

Abstract

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Visceral (LV) está entre as zoonoses mais relevantes transmitidas por vetores. Os pacientes graves com LV apresentam distúrbios sanguíneos gerando dano celular e consequente degradação de heme-proteínas que irão liberar o heme. O heme livre pode ser capaz de alterar o comportamento de neutrófilos bem como moléculas associadas à Leishmania, a exemplo do lipofosfoglicano (LPG). OBJETIVO: Avaliar como o heme e o LPG do parasito interferem na infecção de neutrófilos humanos por Leishmania infantum. MATERIAIS E MÉTODOS: Inicialmente, foram utilizadas amostras de soros de pacientes com LV para correlacionar os níveis de heme com a contagem de neutrófilos no sangue periférico. Em ensaios in vitro, foi observado como a presença do heme intervém na sobrevida e na ativação dos neutrófilos humanos infectados com L. infantum através da citometria de fluxo e ensaio colorimétrico, respectivamente. Com o uso de microscópio de luz, foi feita a contagem em lâminas de neutrófilos infectados por L. infantum em presença do heme e a viabilidade desses parasitos foi mensurada pela contagem de promastigotas viáveis liberados em meio de cultivo. Para estudo da relação do LPG de L. infantum com neutrófilos, neutrófilos humanos foram infectados com parasitos deficientes para LPG (lpg1) para comparar com a infecção de promastigotas selvagens (WT) ou de parasitos que tiveram o seu LPG reconstituído (lpg1+LPG1). A carga parasitária e a viabilidade foram analisadas seguindo a metodologia já citada acima. O status de ativação dos neutrófilos infectados foi avaliado pela produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por citometria de fluxo. RESULTADOS: Em pacientes com LV há uma associação direta entre os níveis de heme e neutropenia. Nos ensaios in vitro, o heme reduz a sobrevida dos neutrófilos humanos infectados com L. infantum através da produção de ROS e liberação de enzimas neutrofílicas, ao mesmo tempo em que favorece a viabilidade do parasito. Os neutrófilos infectados em presença de heme mostraram aumento na atividade enzimática da superóxido dismutase-1 (SOD-1) e com interferência nas vias oxidativas houve redução da taxa de proliferação da L. infantum nestas células. Nos ensaios realizados para análise da interação LPG-neutrófilo, a ausência do LPG em L. infantum lpg1 aumentou a taxa de infecção, mas favoreceu a mortalidade dessas formas em neutrófilos em comparação aos WT ou lpg1+LPG1. No que se refere à ativação dos neutrófilos, houve uma produção expressiva de ROS nas culturas infectadas com L. infantum lpg1, capaz de modular a sobrevivência desses promastigotas. CONCLUSÃO: Neutrófilos humanos sofrem influência do heme à favor da inflamação e sobrevivência do parasito, enquanto que a interação com o LPG da Leishmania reforça a molécula como fator de virulência e de proteção a resposta oxidativa. Esses achados estimulam novas interpretações no contexto da LV e evidenciam a complexidade das interações neutrófilo-parasito a depender do estímulo.