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Title: Estudo dos genes que codificam as proteínas antioxidantes em populações do trypanosoma cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol
Advisor: Murta, Silvane M. Fonseca
Members of the board: Murta, Silvane M. Fonseca
Krieger, Marco Aurélio
Babá, Elio Hideo
Fonseca, Flávio Guimarães da
Campos, Marco Antônio da Silva
Soares, Rodrigo Pinto
Authors: Nogueira, Fernanda Barbosa
Coadvisor: Romanha, Alvaro José
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract: O sistema de defesa antioxidante nos tripanosomatídeos é um potencial alvo para quimioterapia. Este sistema é baseado no tiol de baixa massa molecular “tripanotiona”, que mantêm o ambiente intracelular reduzido pela ação da tripanotiona redutase (TR). As vias que metabolizam o peróxido de hidrogênio em moléculas de água envolvem as enzimas triparedoxina peroxidase citosólica (cTcTXNPx) e mitocondrial (mTcTXNPx) e a ascorbato peroxidase (APX). No presente trabalho, os genes que codificam as enzimas antioxidantes cTcTXNPx, mTcTXNPx, APX e TR foram caracterizados em 18 populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol (BZ). Nossos resultados mostraram que os níveis de mRNA dos genes cTcTXNPx e mTcTXNPx foram duas vezes maior na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ (17LER), do que seu par sensível (17WTS). No entanto, estes genes não estão amplificados no genoma do parasito. Os genes cTcTXNPx e mTcTXNPx podem apresentam oito e duas cópias, respectivamente, dispersas ao longo do genoma do parasito. Análises de western blot, utilizando anticorpos policlonais anti-cTcTXNPx e anti-mTcTXNPx, mostraram que o nível de expressão destas proteínas nativas foi similar para todas as amostras, exceto na população 17LER que apresentou um aumento de duas vezes na expressão. Além disto, a proteína oxidada mTcTXNPx demonstrou uma expressão 5.5 vezes maior na população 17LER, comparada ao par sensível. Análises filogenéticas das proteínas do T. cruzi cTcTXNPx e mTcTXNPx com outros tripanosomatídeos mostraram que elas estão estreitamente relacionados com seus homólogos em T. brucei. A enzima APX do T. cruzi pode ser considerada um bom alvo para drogas, uma vez que ela não é encontrada em hospedeiros mamíferos. O nível de mRNA e número de cópias do gene TcAPX não apresentaram diferenças significativas entre as populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. O gene TcAPX pode apresentar duas cópias dispersas ao longo do genoma do parasito e está localizada em uma banda cromossômica em todas as cepas do parasito analisadas A proteína TcAPX apresentou maior similaridade com a APX de espécies de Leishmania, quando comparada com plantas. Observamos que o nível de expressão da proteína TcAPX foi duas vezes maior na população do T. cruzi com resistência selecionada in vivo ao BZ (BZR), do que seu par sensível (BZS). A tripanotiona redutase é a enzima chave do parasito que mantêm o ambiente intracelular reduzido. O nível de mRNA e o número de cópias do gene TR não apresentaram diferenças significativas nas amostras analisadas. Este gene apresenta uma única cópia no genoma do parasito e está mais relacionado com a TR de T. brucei, comparado com outros tripanosomatídeos. Baseado nos nossos resultados, sugerimos que a população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ exibe um aumento no nível da proteína TXNPx juntamente com outras enzimas associadas com o sistema de defesa antioxidante, como a TcFeSOD-A previamente descrita (Nogueira et al., 2006), protegendo estes parasitos resistentes contra o estresse oxidativo.
Abstract: Antioxidant defense in trypanosomatids have been indicated as a potential target for chemotherapy. This system is based on low molecular weight thiol trypanothione, which maintain the reduced intracellular environment by the action of trypanothione reductase (TR). The pathways that metabolize the hydrogen peroxide to water molecules surrounding the cytosolic (cTXNPx) and mitochondrial (mTXNPx) tryparedoxin peroxidase enzymes and ascorbate peroxidase (APX). In the present work, the genes that encode cTXNPx, mTXNPx, APX and TR antioxidants enzymes were characterized in 18 T. cruzi populations susceptible and resistant to benznidazole (BZ). Our results showed that the levels of cTcTXNPx and mTcTXNPx mRNA were two-fold higher in the T. cruzi population with in vitro-induced resistance to BZ (17LER) than its sensitive pair (17WTS). However, these genes are not amplified in the parasite genome. cTcTXNPx and mTcTXNPx genes can have eight and two copies, respectively, dispersed throughout of the parasite genome. Western blot analysis using anti-cTcTXNPx and anti-mTcTXNPx polyclonal antibodies showed that the expression level of native proteins was similar for all samples, except the 17LER population that showed the expression two-fold more. In addition, the oxidized mTcTXNPx protein demonstrated 5.5- fold greater expression in the 17LER population than 17WTS. Phylogenetic analysis of cTcTXNPx and mTcTXNPx proteins from T. cruzi and other trypanosomatids showed that they are closely related to their homolog in T. brucei. The T. cruzi APX enzyme is considered a good target for drug because it is not found in mammalian hosts. The mRNA level and copy number of the TcAPX gene showed no significant difference between T. cruzi populations susceptible and resistant to BZ. The TcAPX gene presents two copies dispersed throughout of the parasite genome and it is located in one chromosomal band in all T. cruzi strains analyzed. TcAPX protein showed greater similarity to APX from Leishmania than plants. The expression level of TcAPX protein was two-fold more in T. cruzi population with in vivoselected resistance to BZ (BZR), than its susceptible counterpart BZS. Trypanothione reductase is the key enzyme of the parasite to maintain a reduced intracellular environment. The mRNA level and copy number of the TR gene showed no significant difference in the samples analyzed. This gene presents a single copy in the parasite genome and it is more related to TR from T. brucei than other trypanosomatids. Based on our results, we suggest that the T. cruzi population with in vitro resistance to BZ exhibits an increase in TcTXNPx protein levels together with other enzymes associated with peroxide metabolism, such as the previously described TcFESOD (Nogueira et al., 2006), protecting these resistant parasites against oxidative stress.
DeCS: Doença de Chagas
quimioterapia
Trypanosoma cruzi
efeitos de drogas
Antioxidantes
análise
Resistência a medicamentos
genética
Issue Date: 2009
Citation: NOGUEIRA, Fernanda Barbosa. Estudo dos genes que codificam as proteínas antioxidantes em populações do trypanosoma cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol. 2009. 151 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Renê Rachou, Belo Horizonte, 2009.
Date of defense: 2009
Place of defense: Belo Horizonte/MG
Department: Biologia Celular e Molecular
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou
Program: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:MG - IRR - PPGCS - Dissertações de Mestrado

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