Papel das proteínas ABCG1, ABCG4, HMGCoA redutase e ORP1L na homeostasia de colesterol em Leishmania spp

Abstract

Na biossíntese de colesterol em células de mamíferos, a HMGCoA redutase é a enzima limitante da velocidade de síntese. Os tripanossomatídeos têm a sua própria maquinaria para a síntese de esteróis, sintetizando esteróis com esqueleto ergostano. No entanto, uma alta porcentagem de colesterol exógeno é encontrada em Leishmania spp. O transporte de colesterol e outros esteróis em sua forma livre ainda não está bem descrito nesses parasitos, estando as proteínas ABCG1 e ABCG4 relacionadas com o transporte de colesterol e fosfolipídeos em mamíferos. O genoma de Leishmania spp. tem 42 genes da família ABC, mas suas funções ainda estão sendo elucidadas. Em relação à célula hospedeira, a ORP1L é uma proteína presente nos endossomas tardios que interage com o retículo endoplasmático quando a célula apresenta baixos níveis de colesterol. Além disso, a ORP1L já foi identificada no vacúolo parasitóforo de Coxiella burnetii, que é semelhante ao de Leishmania spp. Neste trabalho visamos compreender o papel de algumas enzimas e transportadores na homeostase de esteróis de Leishmania ssp. Para estudar o papel da HMGCoA redutase, da ABCG1 e da ABCG4, foram produzidas cepas de Leishmania spp. superexpressando esses genes. As promastigotas ABCG1high e o HMGCoAhigh apresentaram significativa resistência ao cetoconazol, inibidor da biossíntese de ergosterol (5 vezes e 4 vezes, respectivamente) Após os testes de suscetipibilidade, investigamos a infectividade de cada cepa e observamos que a superexpressão dos genes ABCG1 e 4, levaram a redução na infectividade do parasito. Em relação à atividade antiamastigota, HMGCoAhigh foi resistente ao cetoconazol e à terbinafina; entretanto, ABCG1high e ABCG4high foram sensíveis à terbinafina. Em seguida avaliamos o perfil de esteróis dos parasitos após o tratamento com terbinafina e cetoconazol em meio completo; as cepas ABCG4high e HMGCoAhigh não captaram colesterol exógeno com o tratamento, entretando a ABCG1high captou colesterol do meio de forma dose dependente. O perfil de esteróis em meio deslipidado com oferta ou não de colesterol solúvel não apresentou diferença para a cepa HMGCoAhigh, mas a cepa ABCG4high incorporou menos colesterol solúvel que o controle. Depois disso, avaliamos a captação de NBD-colesterol por citometria de fluxo, em estresse nutricional (privação de esteróis no meio de cultura). As cepas HMGCoAhigh e ABCG4high aumentaram a captação de colesterol até 4 h após a incubação; entretanto, a ABCG1high fez efluxo do colesterol. Para estudar a ORP1L, transfectamos células HeLa e Raw com ORP1L-GFP e detectamos sua presença no vacúolo parasitóforo por fluorescência. Em conjunto, esses resultados mostram que a enzima HMGCoA redutase e os transportadores ABCG1 e ABCG4 desempenham um papel na homeostasia de esteróis e que ORP1L está presente no vacúolo parasitóforo de Leishmania amazonensis.