Padronização das condições de criopreservação de hepatócitos de rato para terapia celular

Abstract

A insuficiência hepática aguda (IHA) é uma síndrome clínica grave e complexa, que se destaca pela súbita perda funcional dos hepatócitos. O transplante hepático ainda é a única opção terapêutica definitiva para a substituição da função hepática. Infelizmente, há grande limitação de doadores, o que contribui para uma alta mortalidade de pacientes. Novas estratégias de suporte ao transplante precisam ser desenvolvidas a fim de minimizar a mortalidade de pacientes em filas de espera. Logo, a proposta do transplante hepatocitário pode melhorar a qualidade de vida até o dia do transplante ou mesmo levar à recuperação do paciente. Contudo, o maior desafio para o uso clínico é a disponibilidade de hepatócitos em boas condições para o transplante e a criopreservação é um fator essencial a esta demanda, uma vez que torna possível o armazenamento de hepatócitos em grande escala. No entanto, hepatócitos são altamente suscetíveis ao processo de congelamento. Dessa forma, este estudo tem como objetivo desenvolver um protocolo de criopreservação de hepatócitos, utilizando substâncias naturais que possam minimizar as criolesões Hepatócitos de ratos foram isolados por dois métodos de dissociação enzimática. A viabilidade celular foi analisada por exclusão do azul de tripan, calceína-AM, iodeto de propídio e pelo método de MTT antes e após a criopreservação. Hepatócitos recém isolados utilizando a enzima colagenase não nos permitiu medir a viabilidade pela técnica de exclusão do azul de tripan. Entretanto, tais células apresentaram atividade metabólica, confirmada pelo ensaio de MTT. O isolamento de hepatócitos de rato com o reagente de digestão Tryple Express mostrou ser eficaz no processo de isolamento das células hepáticas e nos permitiu avaliar a viabilidade em todos os métodos propostos. Além disso, demonstramos que hepatócitos podem ser criopreservados em DMSO a 5%, metade da concentração sugerida pela literatura. Células criopreservadas com 0,2 M de trealose, na ausência de DMSO, apresentaram maior viabilidade quando comparadas àquelas submetidas a apenas 5% de DMSO, demonstrando que a trealose é um potencial agente crioprotetor.