Please use this identifier to cite or link to this item:
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/39496
INIBIÇÃO DA REPLICAÇÃO DO INFLUENZA ATRAVÉS DA MODULAÇÃO DE FATORES RESTRITIVOS PELOS LIGANTES DOS RECEPTORES CCR5 E CXCR4
Silva, Thauane dos Santos Correia da | Date Issued:
2019
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que a gripe é uma doença que afeta com gravidade de 3 a 5 milhões de pessoas em todo o mundo promovendo, anualmente, de 290 a 650 mil mortes. A gravidade da doença pode ser ainda maior quando surgem cepas pandêmicas, para as quais a população tem pouca ou nenhuma imunidade. Portanto, os vírus influenza são considerados os principais agentes virais causadores de infecções respiratórias agudas e tem grande importância epidemiológica. Durante a infecção por influenza, o interferon liberado na resposta imune inata induz cascatas de sinalizações intracelulares, levando a expressão de diferentes genes. Muitos desses genes codificam proteínas nas células, incluindo os fatores de restrição (FRs). É largamente descrito na literatura que os FRs presentes nas células do hospedeiro são proteínas antivirais, que atuam sobre a replicação de diversos vírus, prejudicando o ciclo infeccioso desses patógenos. Nosso grupo já observou que uma proteína do HIV-1, gp120, é capaz de inibir a replicação do vírus influenza A(H1N1)pdm09. Sendo assim, visamos investigar se ligantes dos receptores CCR5 (R5) e CXCR4 (X4) poderiam modular fatores restritivos de forma a inibir a replicação do vírus influenza. Para isso, células A549 foram expostas aos ligantes endógenos dos receptores R5 e X4, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL12 ou exógenos, gp120 R5-trópicos e gp120 X4-trópicos. Então, as células foram infectadas com o vírus A/H3N2 com MOI 2 por 1h. Após 24 h, o título viral foi avaliado por RT-PCR em tempo real. A monocamada celular foi exposta aos ligantes de R5 e lisada para avaliação dos níveis de RNAm de diferentes FRs, utilizando um painel. Em seguida, as células A549 foram expostas aos ligantes de R5 e lisadas para a quantificação do nível proteico do FR SAMHD1 por immunoblotting Realizamos também um ensaio funcional no qual células A549 sofreram knockdown para SAMHD1 e foram infectadas com o A/H3N2. Adicionalmente, as células foram tratadas com guanosina para avaliar o papel regulatório de dNTPs por SAMHD1. Nossos resultados mostraram que a exposição aos ligantes endógenos e exogenos inibiram a replicação do vírus influenza em torno de 50%, em células A549. Através do painel de RNAm para FRs, observamos aumento de 4X dos transcritos para o FR SAMHD1. Observamos também que os ligantes de R5 aumentaram o conteúdo proteico de SAMHD1 em até 3X. Com o experimento funcional de knockdown, observamos que a diminuição dos níveis proteicos de SAMHD1 leva ao aumento da replicação viral, no modelo utilizado. O tratamento com guanosina em células expostas aos ligantes de R5 inibiu ainda mais a replicação do vírus influenza, sugerindo que o mecanismo inibitório possa ser mediado pela ativação da atividade de desoxinucleotídeo trifosfohidrolase de SAMHD1. Sendo assim, nossos dados mostram pela primeira vez uma relação direta de SAMHD1 com inibição da replicação do influenza, além disso, traz perspectivas para novos estudos sobre a modulação de sinalizações, através de receptores celulares, para induzir proteínas de grande importância no controle de infecções virais relevantes para a saúde pública.
Abstract
Data published by the World Health Organization (WHO) shows that influenza is a disease that infects 3 to 5 million people worldwide annually, reaching 290 to 650 thousand deaths. The disease severity can be even greater when pandemic strains, against which the population has little or no immunity, emerge. Therefore, influenza viruses are the main viral agents causing acute respiratory tract infections and are of great epidemiological importance. During influenza infection, the interferon released during the innate immune response induces cascades of intracellular signaling, leading to the expression of different genes, including several encoding restriction factors (RFs). Previous studies from literature show that a variety of RFs have antiviral activity, and are able to interfere with the replication and impair the infectious cycle of different types of viruses. Our group showed that the HIV-1 protein gp120 is able to inhibit the replication of influenza A(H1N1)pdm09 virus. Thus, in the present study, we aimed to investigate whether ligands of the CCR5 (R5) and CXCR4 (X4) receptors could modulate RFs, in order to inhibit the replication of the influenza virus. For this purpose, A549 cells were treated with R5 and X4 endogenous or exogenous ligands, such as CCL3, CCL4, CCL5, CXCL12, gp120 R5-tropic and gp120 X4-tropic. Then, we infected the treated cells with the A/H3N2 virus at multiplicity of infection (MOI) of two for one hour. After 24 hours, the viral titre was evaluated by qRT-PCR. We lysed R5 ligand-treated cells for evaluation of RF mRNA using a quantification panel. Next, R5 ligand-treated cells were lysed for evaluation of FR SAMHD1 protein levels by immunoblotting. We also performed a functional assay in which SAMHD1-knocked-down A549 cells were infected with A(H3N2). In addition, the cells were treated with guanosine to assess the regulatory role of dNTPs by SAMHD1. Our results show that exposure to endogenous and exogenous ligands inhibits influenza virus replication by 50% in A549 cells. Using a RF mRNA quantification panel, we observed a four-fold increase in SAMHD1 transcripts. We also observed that R5 ligands promoted an increase up to three-fold in the protein content of SAMHD1. In the functional knockdown assay, we observed that the decrease of the protein levels of SAMHD1 leads to the increase of viral replication, in A549 cells. Guanosine treatment in cells exposed to R5 ligands further inhibited influenza virus replication, suggesting that the inhibitory mechanism may involve the activation of the SAMHD1 deoxynucleotide triphosphohydrolase activity. Thus, our data show for the first time a direct relationship of SAMHD1 and inhibition of influenza replication and provides perspectives for new studies on the signaling modulation, through cellular receptors, to induce proteins of great importance in the control of infections relevant for public health.
Share