Inibição da replicação do influenza através da modulação de fatores restritivos pelos ligantes dos receptores CCR5 e CXCR4

Abstract

Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que a gripe é uma doença que afeta com gravidade de 3 a 5 milhões de pessoas em todo o mundo promovendo, anualmente, de 290 a 650 mil mortes. A gravidade da doença pode ser ainda maior quando surgem cepas pandêmicas, para as quais a população tem pouca ou nenhuma imunidade. Portanto, os vírus influenza são considerados os principais agentes virais causadores de infecções respiratórias agudas e tem grande importância epidemiológica. Durante a infecção por influenza, o interferon liberado na resposta imune inata induz cascatas de sinalizações intracelulares, levando a expressão de diferentes genes. Muitos desses genes codificam proteínas nas células, incluindo os fatores de restrição (FRs). É largamente descrito na literatura que os FRs presentes nas células do hospedeiro são proteínas antivirais, que atuam sobre a replicação de diversos vírus, prejudicando o ciclo infeccioso desses patógenos. Nosso grupo já observou que uma proteína do HIV-1, gp120, é capaz de inibir a replicação do vírus influenza A(H1N1)pdm09. Sendo assim, visamos investigar se ligantes dos receptores CCR5 (R5) e CXCR4 (X4) poderiam modular fatores restritivos de forma a inibir a replicação do vírus influenza. Para isso, células A549 foram expostas aos ligantes endógenos dos receptores R5 e X4, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL12 ou exógenos, gp120 R5-trópicos e gp120 X4-trópicos. Então, as células foram infectadas com o vírus A/H3N2 com MOI 2 por 1h. Após 24 h, o título viral foi avaliado por RT-PCR em tempo real. A monocamada celular foi exposta aos ligantes de R5 e lisada para avaliação dos níveis de RNAm de diferentes FRs, utilizando um painel. Em seguida, as células A549 foram expostas aos ligantes de R5 e lisadas para a quantificação do nível proteico do FR SAMHD1 por immunoblotting Realizamos também um ensaio funcional no qual células A549 sofreram knockdown para SAMHD1 e foram infectadas com o A/H3N2. Adicionalmente, as células foram tratadas com guanosina para avaliar o papel regulatório de dNTPs por SAMHD1. Nossos resultados mostraram que a exposição aos ligantes endógenos e exogenos inibiram a replicação do vírus influenza em torno de 50%, em células A549. Através do painel de RNAm para FRs, observamos aumento de 4X dos transcritos para o FR SAMHD1. Observamos também que os ligantes de R5 aumentaram o conteúdo proteico de SAMHD1 em até 3X. Com o experimento funcional de knockdown, observamos que a diminuição dos níveis proteicos de SAMHD1 leva ao aumento da replicação viral, no modelo utilizado. O tratamento com guanosina em células expostas aos ligantes de R5 inibiu ainda mais a replicação do vírus influenza, sugerindo que o mecanismo inibitório possa ser mediado pela ativação da atividade de desoxinucleotídeo trifosfohidrolase de SAMHD1. Sendo assim, nossos dados mostram pela primeira vez uma relação direta de SAMHD1 com inibição da replicação do influenza, além disso, traz perspectivas para novos estudos sobre a modulação de sinalizações, através de receptores celulares, para induzir proteínas de grande importância no controle de infecções virais relevantes para a saúde pública.