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EFEITOS DO IGF-1 NA PROLIFERAÇÃO, INVASÃO, ANGIOGÊNESE E POPULAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO TUMORAIS E MODULAÇÃO DAS VIAS HEDGEHOG E PI3K-AKT EM CARCINOMA ESCAMOCELULAR ORAL
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Abstract in Portuguese
INTRODUÇÃO: O carcinoma escamocelular oral (CEO) é o tumor mais frequente da região de cabeça e pescoço, constituindo um importante problema de saúde pública no Brasil. Apesar dos avanços nos estudos moleculares desta doença, especialmente com relação aos dados disponíveis no TCGA, a terapêutica deste tipo tumoral é ainda um desafio, especialmente quando a doença encontra-se nos estágios 3 e 4. A via PI3K-AKT é uma das mais importantes para a tumorigênese e, a ativação desta cascata também pode estar relacionada com a via Hedgehog (HH). Estudos apontam para a relação entre a expressão do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) em células estromais, com a ativação não-canônica da via HH e manutenção da atividade de AKT, contribuindo desta forma, para o comportamento mais agressivo dos tumores. OBJETIVO: Avaliar os efeitos do IGF-1 na expressão de moléculas das vias HH e PI3K-AKT, além de sua participação em eventos pró-tumorigênicos como: proliferação, angiogênese, migração, invasão e população de células-tronco tumorais in vitro. MATERIAL E MÉTODOS: Fibroblastos de pele (MF1) foram geneticamente modificados para superexpressão de IGF-1 por transdução lentiviral (MF1-IGF-1). As células SCC-4 foram incubadas com meio condicionado (MC) de fibroblastos ou rIGF-1 para avaliação da proliferação, migração, expressão de genes de pluripotência, formação de esferas tumorais e identificação de proteínas das vias AKT e HH. O MC também foi usado para o ensaio de angiogênese, feito em linhagem endotelial EA.hy926. Condições de co-cultivo (fibroblastos e SCC-4) foram adotadas para imunomarcação de fatores de pluripotência e da via HH. Fibroblastos e SCC-4 foram semeadas nos diferentes compartimentos do transwell para avaliação da invasão. RESULTADOS: A análise da expressão gênica confirmou a superexpressão de IGF-1 em MF1-IGF-1 e ausência de mRNA para IGF-1 em SCC-4, porém, estas células apresentaram alta expressão do IGF1R. Foi observado o ligante Ihh em MF1 e MF1-IGF-1, e aumento de mRNA de GLI1 em SCC-4 estimuladas com CM MF1. Proteínas das vias HH (GLI1, Ihh e SMO) e AKT (AKT total e fosforilado) foram identificadas em SCC-4 cultivadas na presença de MC MF-1-IGF-1. rIGF-1 promoveu: proliferação, migração, invasão e formação de esferas tumorais. MC MF1 foi o estímulo mais importante para a angiogênese. CONCLUSÕES: rIGF-1 exerceu efeitos pró-tumorigênicos em SCC-4 (proliferação, migração, invasão e esferas tumorais). Porém MC MF1 teve maior influência sob a angiogênese e expressão gênica de GLI1. Proteínas das vias AKT e HH foram identificadas em SCC-4 frente aos diferentes estímulos, sugerindo que a regulação destas vias pelo IGF-1 pode se relacionar aos eventos observados. Entretanto, mais estudos são necessários para comprovar esta relação.
Abstract
INTRODUCTION: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common tumor of the head and neck region, constituting an important public health problem in Brazil. Despite advances in the molecular studies of this disease, especially in relation to data available in the TCGA, therapy of this tumor type is still a challenge, especially when the disease is in stages 3 and 4. The PI3K-AKT pathway is one of the most important for tumorigenesis and activation of this cascade may also be related to the Hedgehog (HH) pathway. Studies point to the relationship between the expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in stromal cells, non-canonical activation of the HH pathway and maintenance of AKT activity, thus contributing to the more normal behavior. aggressive tumors. OBJECTIVE: To evaluate the effects of IGF-1 on the expression of HH and PI3K-AKT pathway molecules, and its participation in pro-tumorigenic events such as proliferation, angiogenesis, migration, invasion and tumor stem cell population in vitro. MATERIAL AND METHODS: Skin fibroblasts (MF1) were genetically engineered for IGF-1 overexpression by lentiviral transduction (MF1-IGF-1). SCC-4 cells were incubated with fibroblast conditioned medium (CM) or rIGF-1 for proliferation, migration, pluripotency gene expression, tumor bead formation, and protein identification of the AKT and HH pathways. CM was also used for the angiogenesis assay, performed in endothelial strain EA.hy926. Co-culture conditions (fibroblasts and SCC-4) were adopted for immunostaining of pluripotency factors and the HH pathway. Fibroblasts and SCC-4 were seeded in different transwell compartments for invasion evaluation. RESULTS: Analysis of gene expression confirmed IGF-1 overexpression in MF1-IGF-1 and absence of IGF-1 mRNA in SCC-4, however, these cells showed high IGF1R expression. Ihh ligand was observed in MF1 and MF1-IGF-1, and increased GLI1 mRNA in CM MF1-stimulated SCC-4. HH (GLI1, Ihh and SMO) and AKT (total and phosphorylated AKT) pathway proteins were identified in SCC-4 cultured in the presence of CM MF-1-IGF-1. rIGF-1 promoted: proliferation, migration, invasion and formation of tumor spheres. MC MF1 was the most important stimulus for angiogenesis. CONCLUSIONS: rIGF-1 exerted pro-tumorigenic effects on SCC-4 (proliferation, migration, invasion, and tumor spheres). However, CM MF1 had greater influence on angiogenesis and gene expression of GLI1. Proteins of the AKT and HH pathways were identified in SCC-4 against different stimuli, suggesting that IGF-1 regulation of these pathways may be related to the observed events. However, further studies are needed to prove this relationship.
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