Plasmódios transfectados com a proteína de fluorescência verde (GFP) para ensaios de quimioterapia experimental

Abstract

A resistência do Plasmodium falciparum aos principais antimaláricos ainda é o principal problema no controle da malária humana. Essa situação gera uma necessidade de se desenvolver novos medicamentos contra a malária bem como ensaios que acelerem o processo de triagem de novas drogas. Recentemente, parasitos da malária transfectados com a Proteína de Fluorescência Verde (GFP) têm sido produzidos em sistema de transformação estável. Isso permite utilizar a fluorescência como um marcador para identificar os parasitos. Assim, buscou-se neste estudo determinar o uso potencial de parasitas da malária murina (P. berghei) e da malária humana (P.falciparum) transfectados com a GFP para os ensaios de quimioterapia experimental. Para os experimentos in vivo, utilizou-se a cepa GFP-P. berghei que apresenta um gene exógeno de fluorescência verde e resistência à pirimetamina (Sultan et al. 1999). Camundongos suíço-albinos ou BALB/c foram infectados com a cepa GFP-P. berghei ou a cepa não transformada (NK65), por via intraperitoneal. Excluindo as drogas com mecanismo de ação similar ao da pirimetamina, os resultados iniciais demonstraram que a susceptibilidade a diferentes classes de antimaláricos foi semelhante entre a cepa GFPP. berghei e a cepa P. berghei NK65. Demonstrou-se ainda que a virulência in vivo da cepa GFP-P. berghei foi similar a da cepa não transformada. A próxima etapa foi validar a cepa GFP-P. berghei em um ensaio fluorimétrico para avaliar drogas antimaláricas. Para tal, os animais foram infectados com a cepa GFP-P. berghei, tratados com antimaláricos convencionais, e as parasitemias avaliadas pela citometria de fluxo ou pelo método convencional de microscopia óptica. A parasitemia determinada pela citometria de fluxo se correlacionou com aquela determinada pela microscopia óptica. Assim, os resultados permitiram concluir que a cepa GFP-P. berghei foi adequada para a triagem de drogas in vivo podendo substituir a técnica convencional de microscopia óptica. Buscando agora validar um protocolo fluorimétrico in vitro para substituir o método de referência de triagem de drogas com hipoxantina tritiada, utilizou-se a cepa GFP-P.falciparum que apresenta fluorescência verde e resistência ao metotrexato (kadekoppala et al. 2000). A cepa GFP-P.falciparum foi mantida em cultivo contínuo e as parasitemias das culturas foram analisadas, em paralelo, por citometria de fluxo e microscopia óptica. Os resultados obtidos in vitro também demonstraram que a quantificação da parasitemia obtida por citometria de fluxo era específica. Finalmente, em ensaios quimioterápicos in vitro, utilizando antimaláricos convencionais, o método fluorimétrico foi similar ao da hipoxantina tritiada. Portanto, os resultados in vitro permitiram concluir que o método fluorimétrico com a cepa GFPP. falciparum se mostrou apto a substituir o método radioativo. A vantagem em se utilizar parasitos transfectados com a GFP em ensaios de triagem de drogas é a simplicidade e facilidade da técnica, não sendo necessário qualquer preparação prévia das amostras para a leitura da fluorescência. O modelo descrito neste trabalho pode funcionar como uma importante ferramenta para acelerar o processo de desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da malária.