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Title: Diagnóstico Molecular da Leishmaniose Visceral Canina e Quantificação da Carga Parasitária Através da Reação em Cadeia da Polimerase
Other Titles: Molecular diagnosis of the Canine Visceral Leishmaniasis and Quantification of the Parasitic Load Through the Polymerase Chain Reaction
Advisor: Gontijo, Célia Maria Ferreira
Authors: Quaresma, Patrícia Flávia
Coadvisor: Murta, Silvane Maria Fonseca
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract: Neste estudo investigou-se a eficácia da PCR para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) e o desempenho da PCR-RFLP para a identificação da espécie de Leishmania. Além disso, a técnica PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi padronizada para a quantificação do número de cópias de kDNA. Foram analisadas amostras de pele, sangue e medula de 217 cães classificados como assintomáticos e sintomáticos. Com base nos resultados de exames sorológicos e parasitológicos convencionais, os animais foram divididos em dois grupos: cães com exames convencionais negativos (ECN = 70) e com exames convencionais positivos (ECP = 147). A presença do parasito em amostras clínicas foi investigada através da amplificação de um fragmento de 120 pb da região conservada do kDNA de Leishmania. Os resultados mostraram que a PCR detectou DNA do parasito até a concentração de 0,1 fg. As amostras pele e medula foram as mais adequadas para a realização do diagnóstico através da PCR. No grupo ECN, 95 por cento dos cães apresentaram PCR positiva em pelo menos uma amostra clínica e no grupo ECP, aproximadamente 96 por cento dos cães foram PCR positivos. A identificação da espécie de Leishmania através da PCR-RFLP revelou que 192 cães estavam infectados por Leishmania infantum chagasi e 2 por Leishmania braziliensis. A análise do real time PCR revelou que na medula dos cães com ECP havia maior número de cópias de DNA de Leishmania do que no sangue e que a comparação da carga parasitária entre os cães sintomáticos e assintomáticos não apresentou diferença significativa. Nossos resultados revelam que a PCR é sensível e útil para detecção de Leishmania em amostras clínicas de cães naturalmente infectados e que a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta rápida e sensível para identificação de espécies. Além disso, o qPCR mostrou ser uma metodologia promissora para estudos de quantificação da carga de DNA de Leishmania
Abstract: In the present investigation, we assessed the effectiveness of polymerase chain reaction (PCR) for canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis as well as restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) for identification of the leishmania species. Moreover, SYBR Green real time PCR was standardized in order to have the number of kDNA copies quantified. Canine samples under analysis comprised skin, blood and bone marrow from 217 dogs, classified into asymptomatic and symptomatic for CVL. The animals were divided into two groups according to results from serological and parasitological conventional examinations: negative conventional examinations (NCE = 70) and positive conventional examinations (PCE = 147). The presence of parasite in clinical samples was investigated through amplification of a 120 bp fragment of the Leishmania kDNA. Our results revealed that PCR showed to be capable to detect Leishmania DNA up to the concentration of 0.1 fg. Skin and bone marrow samples provided the most accurate results by PCR. In group NCE, 95% of the animals showed to be positive for at least one of the clinical samples and, in the group PCE, approximately 96% of the dogs were PCR-positive. PCR amplified products from positive samples were further analyzed by RFLP and the species identified was L. infantum chagasi (192 dogs) and L. braziliensis (2 dogs). Real time PCR has shown that the bone marrow samples from PCE dogs contained a higher number of Leishmania DNA copies than blood; also, the parasitic load between asymptomatic and symptomatic animals showed no significant difference. Our results show that PCR is a sensitive and useful tool for Leishmania detection in clinical samples from naturally infected dogs as well as RFLP, which was capable to provide the species identification. Furthermore, real time PCR showed to be a promising methodology for studies on Leishmania DNA quantification.
keywords: Leishmaniose Visceral
Leishmaniose Visceral Canina
Amostras
Diagnóstico Parasitológico
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Issue Date: 2007
Citation: QUARESMA, Patrícia Flávia. Diagnóstico Molecular da Leishmaniose Visceral Canina e Quantificação da Carga Parasitária Através da Reação em Cadeia da Polimerase. 2007, 118 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) - Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisa René Rachou, Belo Horizonte, 2007.
Place of defense: Belo Horizonte/MG
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Rene Rachou
Program: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Copyright: open access
Appears in Collections:MG - IRR - PPGCS - Dissertações de Mestrado

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