Avaliação da formação de biofilme e análise das proteínas do secretoma e biofilme de Aspergillus fumigatus

Abstract

Sabe-se que as doenças fúngicas acometem vários indivíduos em todo o mundo, porém, a quantidade de pessoas afetadas por essas doenças não é muito bem avaliada devido à falta de dados de vigilância que possam ser utilizados. A aspergilose é uma micose oportunista ocasionada por fungos do gênero Aspergillus, apresenta uma variedade de manifestações clínicas, o que dificulta o seu diagnóstico e possui a espécie Aspergillus fumigatus como o principal agente etiológico. Sabe-se que durante o processo de infecção este fungo secreta uma variedade de proteínas para o seu desenvolvimento bem como tem a capacidade de formação de biofilme. De forma geral, este consiste em uma comunidade microbiana envolta por uma matriz extracelular autopodruzida, a qual funciona como mecanismo de proteção contra ambientes hostis e agentes antifúngicos. Neste sentido, a proteômica é um conjunto de abordagens que pode auxiliar na elucidação de proteínas que estejam envolvidas no processo de infecção causada por esse fungo, bem como aquelas presentes no biofilme. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil proteico do secretoma e da formação de biofilme por Aspergillus fumigatus. Para este estudo, foram utilizadas três cepas de Aspergillus fumigatus (ATCC 16913, ATCC 46640 e ATCC LB-01-AP), as quais foram avaliadas qualitativamente e quantitativamente quanto a produção de biofilme. Nestes ensaios foram utilizados os meios: caldo CZ, SAB, RPMI 1640, BHI e meio mínimo, em diferentes tempos, a 28°C e 37°C. Posteriormente, foi feita a análise por microscopia eletrônica de varredura e o perfil proteico do secretoma e do biofilme foi verificado a partir de um gel de eletroforese unidimensional e pela proteômica shotgun. Os resultados da análise qualitativa para a produção de biofilme mostraram positividade para todas as cepas de Aspergillus fumigatus. Dos cinco meios testados, três foram positivos para a produção do biofilme (CZ, SAB e RPMI 1640) e os demais foram negativos, pois o fungo cresceu demais ou não apresentou aderência na superfície da placa. Na avaliação quantitativa, foi determinada que a melhor condição para produção de biofilme era no meio CZ, a 28°C, no tempo de 36 horas; porém, para análise microscópica e proteômica foram avaliadas as duas temperaturas a fim de verificar se esta influenciava na estrutura e composição proteica do biofilme e secretoma. Na análise por microscopia eletrônica de varredura foi observado que havia diferença no biofilme de acordo com a temperatura, uma vez que a 28°C o biofilme apresentou estruturas arredondadas e compactas, além de uma maior quantidade de conídios em estágio germinativo; já a 37°C foi observada uma maior quantidade de matriz extracelular presente por todo o comprimento da hifa fúngica. Quanto a análise proteômica, foram identificadas uma variedade de proteínas associadas à patogenicidade de Aspergillus fumigatus, que desempenham papéis importantes no seu processo de crescimento, mas que também atuam como alérgenos (e.g. ribonuclease mitogilina, enolase e Hsp90). Adicionalmente, grande parte destes alérgenos identificados no estudo estavam presentes apenas no biofilme do microrganismo. Com isso, verificou-se que há uma diversidade de proteínas no biofilme e secretoma de Aspergillus fumigatus que podem atuar na sua alergenicidade e processo de infecção, as quais também desempenham um importante papel no mecanismo de defesa deste microrganismo durante seu crescimento.