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Title: Avaliação da associação entre expressão da proteína “Kinetoplastid Membrane Protein-11” (KMP-11) e virulência de Leishmania amazonensis
Advisor: Mendonça, Sergio Coutinho Furtado de
Members of the board: Alves, Carlos Roberto
Amaral, Verônica Figueiredo
Pons, Andréa Henriques
Authors: Santos, Elisangela Madureira dos
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: As leishmanioses formam um grupo de doenças que afetam 350 milhões de pessoas atualmente, atingindo 88 países em todo o mundo com uma estimativa de 1-2 milhões de novos casos por ano. O desfecho da infecção causada por Leishmania depende tanto de fatores do patógeno como do hospedeiro, embora a virulência de Leishmania possa ser modulada por fatores ambientais e genéticos relacionados aos hospedeiros mamíferos e vetores, os determinantes moleculares são elementos-chave no estabelecimento da infecção, ou seja, são os fatores que determinam a virulência. A KMP-11 é uma glicoproteína que está presente em todos os cinetoplastideos. O presente estudo avaliou a expressão do gene de KMP-11 de L. amazonensis ao nível de RNA e ao nível de proteína, durante passagens sucessivas de promastigotas de fase estacionária através de cultivo in vitro, investigando se há associação entre a sua expressão e a virulência dos parasitos. A avaliação da virulência dos parasitos mantidos em cultura foi realizada através do acompanhamento da evolução da infecção experimental murina (modelo in vivo) durante um período de dez semanas, juntamente com a observação do surgimento de ulceração. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes das lesões, através da através da técnica de diluição limitante A avaliação também foi realizada pela infecção de macrófagos murinos (modelo in vitro). Os resultados de medição de pata foram analisados pelo teste não paramétrico ANOVA 2 fatores, seguido do pós-teste de Bonferroni. Além disso, foi realizada a determinação da proporção de metacíclicas nos promastigotas de fase estacionária mantidos em cultura, através da técnica de lise pelo complemento. Nossos resultados mostraram que há um decréscimo da virulência dos promastigotas de fase estacionária ao longo do número de passagens, pois os camundongos infectados com as passagens iniciais desenvolveram lesões maiores do que aqueles com os promastigotas mantidos em cultura por mais tempo. Quanto ao surgimento de ulcerações, na 10a semana pós-infecção, todos os animais infectados com promastigotas de 1a passagem apresentavam lesões ulceradas, enquanto que nenhum dos camundongos infectados com promastigotas de 20a passagem apresentava lesão ulcerada. Na infecção in vitro, a carga parasitária nos macrófagos testados diminuiu em função do número das subculturas, o que foi demonstrado através do decréscimo da porcentagem média de macrófagos infectados e pela quantidade média de amastigotas a cada 100 macrófagos infectados. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes da lesão dos camundongos infectados, confirmando a diminuição da virulência dos promastigotas. A quantificação da proporção de promastigotas metacíclicas demonstrou que a porcentagem diminui ao longo do tempo de subcultivo. A avaliação da expressão de KMP-11 na superfície de promastigotas por citometria de fluxo demonstrou um decréscimo na expressão da proteína proporcional ao número de subculturas. Verificou-se, portanto, uma associação entre a expressão da proteína KMP-11 e a virulência de promastigotas de L. amazonensis. Os resultados dos ensaios de PCR em tempo real demonstraram que não há diferença estatisticamente significativa na quantidade de transcritos do gene da proteína KMP-11 entre as passagens analisadas. Entretanto, a perda da virulência associada com a diminuição da expressão da proteína KMP-11 indica que esta molécula possua uma função na infectividade dos promastigotas de Leishmania amazonensis, atuando possivelmente como um fator de virulência.
Abstract: The leishmaniases are a group of diseases that currently, affects 350 million people reaching 88 countries throughout world with an estimated incidence of 1-2 million new cases per year. The outcome of the infection caused by Leishmania depends on factors from the pathogen and from the host. Although Leishmania virulence can be modulated by environmental and genetic factors related to mammalian hosts and vectors, molecular determinants are key elements in the establishment of infection and for the determination, of virulence. KMP-11 is a glycoprotein which is present in all kinetoplastids. This study evaluated the gene expression of KMP-11 in L. amazonensis at RNA level and at protein level, during successive passages of in vitro culture, investigating a possible correlation between KMP-11 expression and virulence of parasites. The evaluation of the virulence of cultured parasites was performed by monitoring of the progression of the lesions in experimental murine infection (in vivo model) during ten weeks, along with the emergence of cutaneous ulcers. The quantification of parasite load was performed on draining lymph nodes using the limiting dilution analysis. The assessment of parasite virulence was also performed by the infection of murine macrophages (in vitro model). The paw measurement results were analyzed by nonparametric test ANOVA 2 way, followed by Bonferroni post-test. Furthermore, the metacyclic promastigotes proportion in stationary growth phase from cultures with different numbers of passages was evaluated by complement lysis. Our results showed a decrease in promastigotes of stationary phase virulence that correlated with the increase of the number of passages, as mice infected with the early passages developed larger lesions than those infected with promastigotes cultured for longer periods and higher numbers of passages. Concerning the development of ulcers, at 10th week post-infection, all animals infected with promastigotes of first passage presented ulcerated lesions, whereas none of the mice infected mice with promastigotes of the 20th passage showed an ulcerated lesion. Analyzing the in vitro infection, the parasite burden in macrophages decreased with the number of subcultures, as demonstrated by the decrease in the percentage of infected macrophages and in the number of amastigotes per 100 infected macrophages. The quantification of parasites in draining lymph nodes of the infected mice confirmed the decrease in the virulence of promastigotes from cultures with more passages. The estimation of the metacyclic promastigote proportions showed that the percentages decline through the time of subculture. The evaluation of KMP-11 expression on the surface of promastigotes by flow cytometry showed a decrease in protein expression proportional to the number of subcultures. Therefore, there was an association between the expression of KMP-11 protein and the virulence of L. amazonensis promastigotes. The results of real-time PCR assays showed that there is no statistically significant difference in the amount of gene transcripts of KMP-11 protein in the analyzed passages. However, the loss of virulence associated with decreased protein expression of KMP-11 indicates that this molecule may have a role in promastigotes infectivity of Leishmania amazonensis, possibly acting as a virulence factor.
DeCS: Leishmania mexicana 
Infecção
Murinae  
Virulência
Kinetoplastida
Proteínas de Membrana
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
Análise de Sequência de RN
Análise de Variância
Issue Date: 2011
Citation: Avaliação da associação entre expressão da proteína “Kinetoplastid Membrane Protein-11” (KMP-11) e virulência de Leishmania amazonensis. 2011. 93f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2011
Date of defense: 2011-04-28
Place of defense: Rio de Janeiro / RJ
Department: Pós-graduação em Biologia Parasitária
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária
Copyright: open access
Appears in Collections:IOC - PGBP - Dissertações de Mestrado

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