Uso de sangue seco em papel de filtro para detecção, quantificação e sequenciamento do vírus da hepatite B

Abstract

O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é realizado em amostras de soro ou plasma, porém o custo é alto e o acesso a esse diagnóstico é difícil em regiões com poucos recursos. O uso de sangue seco em papel de filtro (DBS) surge como uma alternativa, pois não necessita de estrutura especial para coleta, armazenamento ou transporte. Este estudo teve por objetivo avaliar o uso de DBS para detecção, quantificação e sequenciamento do DNA do HBV, a fim de contribuir para ampliar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas. Para tanto, quatro grupos de estudo foram incluídos na análise: I \2013 um painel de diluição seriada em DBS; II \2013 92 indivíduos HBsAg reagentes e com o DNA do HBV detectado; III \2013 49 indivíduos controle negativo; IV \2013 28 indivíduos com anti-HBc isolado no soro. Inicialmente, foi definido o protocolo mais eficiente para extração e detecção do HBV DNA em DBS. Dois tipos de papéis de filtro (Whatman 903 e FTA), quatro conjuntos de extração comerciais (três com coluna de sílica e um com resina), duas regiões-alvo para a PCR qualitativa (core e S/pol) e uma PCR em tempo real (qPCR) para a região pré-S2/S do HBV foram avaliados. Em seguida, amostras de soro e DBS dos grupos II e III foram submetidas à qPCR in house e PCR qualitativa para a região S/pol do HBV. As amostras de soro e DBS detectadas na PCR qualitativa foram submetidas ao sequenciamento nucleotídico para determinação de genótipos e análise de mutações de resistência. No grupo IV, as amostras foram testadas pela PCR qualitativa para a região S/pol do vírus Na análise do painel I, verificamos menor limite de detecção de HBV em amostras de papel de filtro Whatman 903, extraídas com o conjunto de extração High Pure Viral Nucleic Acid (Roche) pela PCR qualitativa do gene S/pol e na qPCR. A qPCR em DBS apresentou sensibilidade de 77,63% e especificidade de 100%, com limite de detecção de 852,5 cópias/mL, boa repetitividade e estatística Kappa de 0,731. A PCR qualitativa em DBS apresentou sensibilidade de 75% e especificidade de 100% com estatística Kappa igual a 0,689. Um total de 63 amostras de soro e 36 amostras de DBS foram submetidas ao sequenciamento. Em soro: 65,08% eram do genótipo A; 27% do F; 4,8% do D; e 3,2% do E; em DBS: 63,8% eram do genótipo A; 27,8% do F; 5,6% do D; e 2,8% do E. Todas as amostras pareadas de soro e DBS foram classificadas no mesmo genótipo. Um indivíduo apresentou mutação de resistência à lamivudina e à telbivudina, com resistência parcial ao entecavir em soro e DBS. Por fim, foi possível detectar o DNA do HBV em 32,14% das amostras de soro e 14,29% das amostras de DBS de indivíduos que apresentaram anti-HBc isolado no soro. Concluímos que é possível detectar, quantificar e genotipar o DNA do HBV em amostras de DBS, o que pode ser uma alternativa ao soro para o aumento do acesso ao diagnóstico da infecção em regiões remotas.