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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/43248
ESTUDO DOS PERFIS INFLAMATÓRIO E CITOTÓXICO DE LINFÓCITOS T DE MULHERES EXPOSTAS AO VÍRUS ZIKA DURANTE GESTAÇÃO: IMPACTO DA MODULAÇÃO DOS RECEPTORES CCR5 E CX3CR1 NA RESPOSTA DAS CÉLULAS T
Macedo, Débora Familiar Rodrigues | Date Issued:
2019
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Em 2015-2016, o vírus zika (ZIKV) foi o agente causador de um surto importante de zika no Brasil. A maioria dos indivíduos infectados pelo ZIKV são assintomáticos e naqueles sintomáticos, a doença é em geral branda e autolimitada. Mas, existem relatos de alterações neurológicas associadas ao ZIKV, como a síndrome de GuillainBarré em adultos e a Síndrome Congênita do Zika (SCZ) em crianças nascidas de mães infectadas pelo vírus na gravidez. Considerando-se que ZIKV e DENV compartilham em média 43% de identidade de aminoácidos nas 10 regiões da poliproteína viral e que, o surto de ZIKV se deu em regiões endêmicas do DENV, vários questionamentos vêm sendo levantados. Dentre eles, se existe uma imunidade cruzada entre ZIKV e DENV e qual a consequência disso no desfecho clínico do paciente. Neste estudo, pretendemos avaliar os perfis inflamatório e citotóxico dos linfócitos T CD4+ e CD8+ de memória específicos ao ZIKV, associando a funcionalidade das células T à expressão dos receptores de quimiocinas CCR5 e CX3CR1. Para isso, vamos caracterizar a resposta dos linfócitos T de memória de mulheres que foram infectadas pelo ZIKV durante a gravidez em 2016-2017 na região Metropolitana II do RJ. As amostras de sangue foram coletadas dois ou três anos após a fase aguda da doença (2018-2019), para o estudo da memória imunológica ao ZIKV. Vinte e duas mães foram avaliadas e comparadas de acordo com o desfecho clínico de seus filhos: o 1° grupo foi constituído de mães que tem filhos assintomáticos (n=12) e o 2°grupo, mães com filhos que apresentam alterações características da SCZ (n=10). Utilizamos um conjunto de peptídeos derivados do ZIKV (megapools de ZIKV) restrito a ligação aos HLAs de classe I e II, portanto, indutores de resposta das células T CD8+ e CD4+ Esses megapools são representativos das 10 regiões da poliproteína viral consideradas imunogênicas e, foram definidos segundo percentuais de identidade de aminoácidos entre DENV e ZIKV. As PBMCs foram estimuladas in vitro com os megapools de ZIKV e analisadas no ensaio de EliSpot para detecção de células produtoras de IFN-\03B3, detecção de IFN-\03B3 intracelular e avaliação da expressão da proteína de grânulo CD107a e dos receptores de quimiocinas CCR5 e CX3CR1 por citometria de fluxo. Por fim, ensaios de bloqueio dos CCR5 e CX3CR1 foram realizadas na tentativa de entender o papel desses receptores na funcionalidade das células. Nossos resultados indicam que independente do desfecho clínico da criança, mais de 60% das mulheres apresentam anticorpos IgG anti-DENV e IgG anti-ZIKV. Em relação a funcionalidade das células, é possível observar que mães de crianças assintomáticas apresentam maior tendência a magnitude de produção de IFN-\0263, assim como de frequência de respondedores comparado as mães de bebês com SCZ. No intuito de distinguir as respostas das CD4 e CD8, realizamos ensaio de citometria de fluxo. Observamos que os megapools de ZIKV nas células das mulheres com filhos assintomáticos, tendem a: induzir maior resposta das células T CD4+IFN-\03B3+, menor resposta CD4+CD107a+, maior resposta CD4+CCR5+ e resposta similar das CD4+CX3CR1+ comparado as mães com filhos com SCZ Já nas células T CD8+, os megapools de ZIKV induzem uma resposta similar das células T CD8+IFN-\03B3+ e CD8+CX3CR1+ específicas entre os grupos de mães, com uma frequência de respondedores muito baixa. Mas, a resposta das células T CD8+CD107a+ e das CD8+CCR5+ específicas foi maior nas mães com filhos com SCZ comparado àquelas com filhos assintomáticos. No geral, as células T CD4+ e CD8+ produtores de IFN-\03B3 e que expressam CD107a são predominantemente CCR5+CX3CR1+ nos dois grupos de mães. Nos ensaios in vitro, parece que o bloqueio da expressão de CCR5 ou CX3CR1 não altera a produção de IFN-\03B3 nas células expostas ao ZIKV. Mas, os bloqueios interferem na atividade citotóxica das células TCD8+ quando expostas ao ZIKV e nas células T CD4+ quando expostas aos megapools de ZIKV. Assim, concluímos a imunidade ao DENV não teve uma influência importante no desfecho clínico de filhos expostos via transmissão vertical. Ainda, que um perfil mais inflamatório e menos citotóxico das células T CD4+ das mães pode ter influenciado no desfecho clínico mais brando de seus filhos. Mas, parece que a resposta inflamatória e citotóxica das células T CD8+ tem menos impacto na doença e no desfecho clínico dos bebês. Mais experimentos devem ser realizados sobre o efeito do bloqueio de CCR5 e CX3CR1 na funcionalidade das células T.
Abstract
In 2015-2016, Zika virus (ZIKV) was the causative agent of a major outbreak of Zika in Brazil. Most individuals infected with ZIKV are asymptomatic and in those symptomatic, the disease is usually mild and self-limiting. But there are reports of neurological changes associated with ZIKV, such as Guillain-Barré syndrome in adults and Congenital Zika Syndrome (CZS) in children born from mothers infected with the virus in pregnancy. Considering that ZIKV and DENV share on average 43% of amino acid identity in the 10 viral polyprotein regions and that the ZIKV outbreak occurred in endemic regions of DENV, several questions have been raised. Among them, if there is a cross immunity between ZIKV and DENV and what is the consequence on the patient's clinical outcome. The aim of this study is to evaluate the inflammatory and cytotoxic profiles of ZIKV-specific CD4+ and CD8+ memory T lymphocytes by associating T cell functionality with CCR5 and CX3CR1 chemokine receptor expression. To this end, we will characterize the memory T-lymphocyte response of women who were infected with ZIKV during pregnancy in 2016-2017 in the Metropolitan Region II of RJ. Blood samples were collected two or three years after the acute phase of the disease (2018-2019) for the study of ZIKV immunological memory. Twenty-two mothers were assessed and compared according to their children's clinical outcome: the first group consisted of mothers with asymptomatic children (n= 12) and the second group mothers with children who had characteristic changes of CZS (n= 10). We used a set of ZIKV-derived peptides (ZIKV megapools) restricted to binding to class I and II HLAs, thus inducing CD8+ and CD4+ T-cell response These megapools are representative of the 10 regions of viral polyprotein considered immunogenic and were defined according to aminoacid identity between DENV and ZIKV. PBMCs were stimulated in vitro with ZIKV megapools and analyzed in the EliSpot assay for detection of IFN-\03B3 producing cells, detection of intracellular IFN-\03B3, and evaluation of CD107a granules protein expression and CCR5 and CX3CR1 chemokine receptors by flow cytometry. Finally, CCR5 and CX3CR1 blockade assays were performed to understand the role of these receptors in cell functionality. Our results indicate that regardless of the child's clinical outcome, more than 60% of women have anti-DENV IgG and antiZIKV IgG antibodies. Regarding the functionality of cells, it is possible to observe that mothers of asymptomatic children has greater tendency to the magnitude of IFN-\0263 production, as well as the frequency of responders compared to mothers of babies with CZS. In order to distinguish CD4 and CD8 responses, we performed flow cytometry assay. We observed that ZIKV megapools in cells of women with asymptomatic children tend to: induce higher CD4+IFN-\03B3+ T cell response, lower CD4+ CD107a+ response, higher CD4+CCR5+ response and similar CD4+CX3CR1+ response compared to mothers with children with SCZ In CD8+ T cells, ZIKV megapools induce a similar response of specific CD8+ IFN-\03B3+ and CD8+ CX3CR1+ T cells between the mother groups, with a very low frequency of responders. But the response of CD8+ CD107a+ T cells and specific CD8+ CCR5+ T cells was higher in mothers with children with SCZ compared to those with asymptomatic children. In general, IFN-\03B3 producing CD4+ and CD8+ T cells expressing CD107a are predominantly CCR5+ CX3CR1+ in both groups of mothers. In in vitro assays, it appears that blocking CCR5 or CX3CR1 expression does not alter IFN-\03B3 production in cells exposed to ZIKV. But blockages interfere with the cytotoxic activity of TCD8+ cells when exposed to ZIKV and CD4+ T cells when exposed to ZIKV megapools. Thus, we concluded that DENV immunity did not have an important influence on the clinical outcome of children exposed via vertical transmission. Moreover, that a more inflammatory and less cytotoxic profile of mothers' CD4+ T cells may have influenced the milder clinical outcome of their children. But it appears that the inflammatory and cytotoxic response of CD8 + T cells has less impact on the disease and clinical outcome of infants. Further experiments should be performed on the effect of CCR5 and CX3CR1 blockade on T-cell functionality.
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