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APLICAÇÃO DO SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO NO DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA SÍNDROME DE PRADER-WILLI
Sequenciamento de Nova Geração
Biologia Computacional
Deleção
Diagnóstico Molecular
Dissomia Uniparental
Defeito no centro de imprinting
Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala
Análise de sequência de DNA
Técnicas de diagnóstico molecular
Author
Advisor
Co-advisor
Affilliation
Abstract in Portuguese
Introdução: A síndrome de Prader- Willi (SPW) é uma desordem genética complexa, caracterizada por deleções, dissomia uniparental materna ou defeito no centro de imprinting no alelo paterno do cromossomo 15. As perdas de funções de genes específicos da região 15q11 afetam múltiplos sistemas corporais. O diagnóstico da SPW envolve a realização de diversas técnicas de biologia molecular e citogenética para a completa elucidação do mecanismo genético relacionado ao desenvolvimento da síndrome, tornando todo o processo laborioso, demorado e custoso. Objetivo: Aplicação da tecnologia sequenciamento de nova geração (NGS), plataforma Ion Torrent PGM, para diagnostico molecular da SPW. Materiais e Métodos: Foram incluídos 17 pacientes suspeitos para SPW onde foram submetidos a análise de metilação (MS-HRM), citogenética (GTG e FISH) e sequenciamento de genes alvos na plataforma Ion Torrent PGM, e subsequente confirmação de variantes através da técnica de sequenciamento de Sanger. Resultados: A análise de metilação detectou 6 indivíduos portadores da SPW, 1 portador da Síndrome de Angelman (SA) e 10 indivíduos normais. A técnica de GTG identificou 1 indivíduo com uma grande perda cromossômica, já a metodologia de FISH identificou 3 indivíduos com deleções, totalizando 4. O bom desempenho da tecnologia de sequenciamento NGS, através da metodologia Ion Torrent PGM, permitiu a realização de análises de frequência alélica, variação do número de cópias (CNV) e de mutações específicas do genoma. As análises por bioinformática realizadas nos dados do NGS permitiram detectar 4 pacientes portadores de deleção, classificando-as como Tipo 1 ou Tipo 2. Além disso, foi possível identificar um evento raro de dissomia uniparental segmentar, com complicações prognósticas severas Identificou-se variantes do tipo INDEL no gene PWRN1 em 2 pacientes, onde, o impacto funcional desta mutação ainda não foi estudado. Contudo o gene possui forte correlação com o desenvolvimento da SPW. A metodologia também identificou uma mutação INDEL no gene MAGEL2 em um paciente com padrão de metilação normal no MS-HRM, sugerindo a identificação de uma síndrome análoga a SPW. Todas as variantes detectadas foram validadas através do sequenciamento de Sanger. Conclusão: A plataforma Ion Torrent identificadou todas as alterações relacionadas ao desenvolvimento da SPW. O pipeline desenvolvido mostrou-se aplicável a uma rotina diagnóstica.
Abstract
Introduction: Prader-Willi syndrome (PWS) is a complex genetic disorder characterized by deletions, maternal uniparental disomy or defect at the imprinting center in the paternal allele of chromosome 15. Loss of 15q11 region-specific gene functions affects multiple body systems. The diagnosis of SPW involves the accomplishment of several techniques of molecular biology and cytogenetics for the complete elucidation of the genetic mechanism related to the development of the syndrome, making the whole process laborious, time-consuming and costly. Objective: Application of the Next-Generation sequencing technology (NGS), platform Ion Torrent PGM, for molecular diagnosis of PWS. Materials and Methods: Seventeen suspected patients for SPW were submitted to methylation (MS-HRM), cytogenetic analysis (GTG and FISH) and sequencing of target genes in the Ion Torrent PGM platform, and subsequent confirmation of variants by the technique of sequencing of Sanger. Results: Methylation analysis detected 6 individuals with SPW, 1 with Angelman Syndrome (AS) and 10 normal individuals. The GTG technique identified 1 individual with a large chromosomal loss, and the FISH methodology identified 3 individuals with deletions, totaling 4. The good performance of the NGS sequencing technology, through the Ion Torrent PGM methodology, allowed the performance of frequency analyzes allelic, copy number variation (CNV), and genome-specific mutations. The bioinformatics analyses performed on the NGS data allowed the detection of 4 patients with deletion, classifying them as Type 1 or Type 2. In addition, it was possible to identify a rare segmental uniparental disomy with severe prognostic complications. Variables of the INDEL type were identified in the PWRN1 gene in 2 patients, where the functional impact of this mutation has not been studied. However, the gene has a strong correlation with the development of PWS The methodology also identified an INDEL mutation in the MAGEL2 gene in a patient with normal methylation pattern in MS-HRM, suggesting the identification of a syndrome similar to PWS. All detected variants were validated through Sanger sequencing. Conclusion: The Ion Torrent platform has identified all the changes related to the development of PWS. The pipeline developed proved to be applicable to a diagnostic routine.
Keywords in Portuguese
Síndrome de Prader-WilliSequenciamento de Nova Geração
Biologia Computacional
Deleção
Diagnóstico Molecular
Dissomia Uniparental
Defeito no centro de imprinting
DeCS
Síndrome de Prader-WilliSequenciamento de nucleotídeos em larga escala
Análise de sequência de DNA
Técnicas de diagnóstico molecular
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