Efeito de substâncias fenólicas presentes na dieta humana sobre enzimas da subfamília CYP2C

Abstract

Substâncias fenólicas estão presentes em frutas, vegetais e suplementos dietéticos; possuem diversas atividades biológicas e, por isso, estão associadas à prevenção de desordens crônicas, principalmente, àquelas associadas pelo estresse oxidativo. É importante avaliar seus efeitos sobre as enzimas do citocromo P450 (CYPs) que são responsáveis pelo metabolismo de xenobióticos, que, em humanos é realizado principalmente por três famílias: CYP1, CYP2 e CYP3. O CYP2C é a segunda subfamília mais abundante, responsável pelo metabolismo de aproximadamente 20% dos fármacos atualmente disponíveis no mercado. A inibição das CYPs é a causa mais comum de interações droga-droga prejudiciais que têm levado à remoção de vários medicamentos do mercado. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi estabelecer métodos de experimentação in vitro para avaliar o efeito de substâncias fenólicas presentes na dieta humana sobre as enzimas da sub-família CYP2C. Ratas Wistar foram tratadas (v.o.) com rifampicina por 9 dias com doses de 300 mg/kg/dia, seus fígados foram removidos e as induções das CYPs 2E1 e 3A foram confirmadas. Os microssomos foram utilizados para testar a atividade inibitória in vitro da CYP2C11 (ortóloga da CYP2C9 de humanos) por substâncias fenólicas, na concentração de 1mg/mL em 20 min de incubação. No estudo de cinética, a CYP recombinante humana (rhCYP2C9*1, BD Bioscience) e uma fração microssomal de Ratas Wistar foram testadas para avaliar a conversão de 100 \03BCM de diclofenaco de sódio (DCF, substrato) ao 4´-hidroxidiclofenaco (4´-OH-DCF), principal produto da reação. A avaliação da reação foi realizada por cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) acoplada a detector de ultravioleta em rede de diodos (DAD-UV), no equipamento Shimadzu Nexera XR. Diferentes colunas e fases móveis foram testadas para análise do produto de reação por CLUE-DAD-UV. As melhores condições cromatográficas foram obtidas com a coluna utilizando água ultrapura acidificado com ácido acético glacial (pH = 3,0), fluxo de 0,25 \03BCL / mpara o DCF foi registrado entre 8,32 - 8,40 min e para o 4´OH-DCF entre 4,89-4,95min. O fator de retenção obtido para o produto de reação (4´-OH-DCF) foi 5,8 e para o substrato (DCF) 10,6 e a resolução cromatográfica foi calculada em 6,0, portanto, as condições cromatográficas obtidas para a quantificação do 4´-OH-DCF foram excelentes. A melhor concentração enzimática da rhCYP2C9*1 para conversão ao produto foi 75 pmol / mL em 10 min de incubação em 37°C. Diferentes concentrações do substrato (0,78 - 100 \03BCM) foram incubadas com enzima nessas condições. A quantificação do produto permitiu a obtenção da velocidade máxima da reação (3,1 \03BCg 4´-OH-DCF/mg ptn / min) e a constante de Michaelis-Menten (Km = 2,80 \03BCM, Lineawer-Burke). O valor do Km foi confirmado com o gráfico de Eadie Hofstee (Km=2,96 \03BCM) mas não foi confirmado pelo gráfico de Hanes-Woolf (Km = 6,68 \03BCM). Os flavonoides testados rutina, hesperidina e quercetina (100 \03BCM) demonstraram inibição da CYP2C, sendo a rutina o flavonoide mais ativo (21%). Os ácidos fenolicos testados ácidos cafeico, vanílico e p-cumárico (100 \03BCM) não inibiram a CYP2C, porém, o ácido ferúlico que demonstrou uma discreta inibição. O CGA não foi testado nesta dissertação por apresentar impurezas, serão realizados estudos futuros com esta substância. Esses resultados são importantes e guiarão os estudos de inibição em rhCYP2C9*1.