Estudo das proteases fibrinolíticas de bactérias e fungos da Coleção Biológica da Fiocruz Amazônia-CBILMD: caracterização bioquímica e expressão recombinante da enzima fibrinolítica de Serratia marcescens

Abstract

A pesquisa de agentes fibrinolíticos tem sido direcionada para a descoberta de proteases microbianas com atividade semelhante à da plasmina para propor agentes trombolíticos alternativos para o tratamento da trombose. A trombose é caracterizada pela formação de coágulo sanguíneo, composto por fibrina, responsável por causar a obstrução na parede do vaso, sendo considerada uma das principais causas de doenças cardiovasculares da vida moderna. Com isso, o objetivo desse estudo foi identificar proteases fibrinolíticas de bactérias e fungos estocados no acervo da Coleção Biológica da Fiocruz Amazônia (CBILMD) e selecionar uma biomolécula com potencial terapêutico para posterior expressão sob forma recombinante em E. coli. Para investigar a atividade fibrinolítica, foram reativados 150 fungos da coleção e foram isoladas 150 bactérias de solo e água do bioma Amazônia. As culturas foram submetidas a fermentação submersa para obtenção do filtrado de cultura e posterior realização dos testes enzimáticos: placa de ágar leite, placa de fibrina e quantificação da atividade fibrinolítica. Para a produção e caracterização das enzimas fibrinolíticas nativas, os cinco microrganismos que apresentaram maior produção de protease seguiram para as etapas de análise temporal da secreção enzimática, purificação, testes fibrinolíticos, caracterização bioquímica das enzimas quanto ao efeito do pH, temperatura, íons metálicos e inibidores enzimáticos e teste de hemólise. Para a produção da enzima recombinante, selecionou-se Serratia marcescens CBAM 519 para identificação do gene codante para protease fibrinolítica. O material foi analisado na Plataforma de Sequenciamento de Ácidos Nucleicos de Nova Geração (FIOCRUZ/IOC – RJ) O gene de S. marcescens CBAM 519 (sm519) que codifica a enzima fibrinolítica SM519 foi obtido por PCR e clonado no vetor de expressão pET23a(+). Os resultados demonstram que as enzimas nativas de Penicillium citrinum CFAM 521, P. citrinum CFAM 592, Aspergillus flavus CFAM 367, Serratia marcescens CBAM 519 e Pseudomonas aeruginosa CBAM 529 apresentaram pH e temperatura ótimos de 9 e 37°C, respectivamente, com atividade reduzida na presença de Cu2+ e potencializada na presença de Mn2⁺. As enzimas não apresentaram atividade hemolítica, não ativaram o plasminogênio e hidrolisaram efetivamente a fibrina e o fibrinogênio, degradando rapidamente todas as cadeias de fibrinogênio (Aα, Bβ e γ). O peso molecular das enzimas variou entre 35 e 56 kDa. As enzimas de P. citrinum CFAM 521 e CFAM 592 foram classificadas como serina proteases, enquanto as enzimas de A. flavus CFAM 367, S. marcescens e Pseudomonas aeruginosa CBAM 529 como metalo-serino proteases. A enzima de S. marcescens CBAM foi expressa com sucesso em E. coli cepa BL21(DE3) na fração insolúvel, em corpos de inclusão, mas renaturado com sucesso, com peso molecular de aproximadamente 55kDa. A expressão em sistema heterólogo preservou as características da enzima nativa, sem causar mudanças expressivas nos parâmetros físico-químicos. A enzima recombinante (rSM519) manteve sua ação fibrinolítica e fibrinogenolítica, especialmente na clivagem das cadeias α e β e compartilha características de protease semelhante à plasmina. Todas essas características combinadas levam à conclusão de que a protease fibrinolítica recombinante de S. marcescens CBAM 519 (rSM519) apresenta potencial para uso como agente terapêutico no tratamento e prevenção da trombose