Padronização de uma PCR duplex para diagnóstico diferencial da leishmaniose tegumentar e esporotricose

Abstract

A leishmaniose tegumentar (LT) e a esporotricose são doenças cutâneas com características clínicas semelhantes. A reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção do complexo Sporothrix schenckii e Leishmania spp. vem sendo integrada a rotina de laboratórios da rede pública e privada, aumentando a rapidez, precisão e sensibilidade diagnóstica. Nesse contexto, pretendeu-se nesse estudo desenvolver um protocolo de PCR duplex para detecção de Sporothrix schenckii sensu stricto (s.s.) e Leishmania braziliensis. Inicialmente, foi realizada uma PCR uniplex, onde os primers (S2/R2 e B1/B2) foram testados individualmente com os seus respectivos alvos, e, em seguida, um primeiro sistema duplex foi testado. Para otimização da PCR duplex, realizaram-se ajustes nas concentrações do MgCl2, da Taq DNA polimerase e de cada par de primers, bem como, na temperatura de anelamento, até que os ensaios resultassem em um protocolo onde os alvos fossem amplificados simultaneamente e com sensibilidade analítica equivalente. Os resultados obtidos com os protocolos no formato uniplex demonstraram uma sensibilidade analítica de 0,5 pg de DNA para L. braziliensis e de 5 pg de DNA para S. schenckii s.s. Enquanto que, os ensaios de PCR duplex apresentaram detecção até o ponto com 0,5 pg de DNA de ambos os patógenos. Os protocolos padronizados não demonstraram amplificações inespecíficas ou cruzadas com o DNA dos outros organismos testados. Diante disso, concluí-se que a PCR duplex padronizada no presente estudo permite a detecção e diferenciação de L. braziliensis e S. schenckii s.s. com alta sensibilidade e especificidade. Como também, poderá, após validação, adequar-se a rotina de laboratórios clínicos, centros de pesquisa e universidades, contribuindo para o diagnóstico diferencial da LT e esporotricose e auxiliando na escolha da abordagem terapêutica mais conveniente ao caso.