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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/53289
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DissertationCopyright
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Sustainable Development Goals
03 Saúde e Bem-EstarCollections
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RESPOSTAS IMUNES INDUZIDAS POR VACINAS DE DNA CONTRA ZIKA E NEUROADAPTAÇÃO DE UM ISOLADO VIRAL EM CAMUNDONGOS PARA FUTUROS TESTES DE VACINAS
Pacheco, Ágatha Rezende | Date Issued:
2021
Author
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Em geral, a doença causada pelo vírus Zika (ZIKV) é clinicamente semelhante às de outros arbovírus. No entanto, ocasionalmente ela é associada a síndromes neurológicas como a síndrome de Guillain-Barré. Além disso, durante a gravidez a infecção pode causar a síndrome congênita do zika, com danos cerebrais e sistêmicos no feto e/ou bebês, incluindo microcefalia. O genoma do ZIKV codifica três proteínas estruturais, capsídeo, pré-membrana/membrana e envelope (E), e sete proteínas não estruturais (NS1-5). As proteínas E e NS1 são indicadas como antígenos promissores, sendo consideradas alvos importantes no desenho de vacinas contra diversos flavivírus. Nosso grupo construiu dois plasmídeos recombinantes que codificam o ectodomínio da proteína E (pZKectoE) e a proteína NS1 (pZKNS1) do ZIKV. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade desses plasmídeos de mediar a expressão de proteínas recombinantes e induzir respostas imunes. Células BHK-21 foram transfectadas com estes plasmídeos e a expressão das proteínas recombinantes foi avaliada. Como esperado, o pZKectoE e o pZKNS1 mediaram a expressão das proteínas recombinantes E e NS1, respectivamente. A ativação das respostas imunes humoral e celular em camundongos foi avaliada por ELISA e por ELISPOT. Ambos os plasmídeos induziram títulos de anticorpos específicos significativamente mais elevados do que o plasmídeo controle (pcTPA). Além disso,induziram respostas de células T com produção de IFN-γ após estimulação com duas bibliotecas de peptídeos derivadas de E e NS1. O mapeamento de peptídeos imunogênicos através de ensaios de ELISPOT identificou cinco epítopos imunodominantes na proteína E e três na proteína NS1. A maioria dos modelos murinos para estudos de ZIKV usa animais imunocomprometidos, que fornecem infecções robustas e letais, mas talvez não sejam ideais para testes de vacinas. Portanto, a fim de estabelecer um modelo murino imunocompetente suscetível à infecção pelo ZIKV, iniciamos experimentos de neuroadaptação de um vírus isolado de um paciente no Brasil, por sucessivas passagens no cérebro de camundongos recém-nascidos. Grupos de camundongos Swiss, com idades entre três e nove dias, foram infectados pela via intracerebral com ZIKV. No sétimo dia após a infecção, os animais foram eutanasiados e os cérebros foram coletados. As amostras foram tituladas por ensaio de plaques em células Vero. Em cada passagem, a amostra com o título viral mais alto foi usada para inoculação subsequente no cérebro de outros camundongos recém-nascidos. Nossos resultados mostraram uma alteração na morfologia do plaque produzido pela infecção com o vírus em comparação àquelas observadas com a amostra inicial de ZIKV. Em relação à carga viral, houve um aumento de 4 log durante as primeiras quatro passagens, seguido por uma ligeira redução e o sequenciamento do genoma viral revelou algumas mutações pontuais. De modo geral, as vacinas pZKEctoE e pZKNS1 foram capazes de mediar a expressão das proteínas recombinantes E ou NS1 com ativação das respostas imunes humoral e celular. Até o momento, não foi possível o estabelecimento de um modelo murino imunocompetente. Para obtenção do vírus neuroadaptado, com capacidade de causar sinais clínicos da infecção em animais adultos, deverão ser realizadas mais passagens em cérebros de camundogos Swiss
Abstract
In general, the disease caused by Zika virus (ZIKV) is clinically similar to those of other arboviruses. However, occasionally it has been associated with neurological syndromes such as Guillain-Barré syndrome. Yet, ZIKV infections during pregnancy may cause the Congenital Zika Syndrome, with brain and systemic damages in the fetus and/or infants, including microcephaly. The genome of ZIKV encodes three structural proteins, capsid, pre-membrane/membrane and envelope (E), and seven non-structural proteins (NS1-5). The E and NS1 proteins are indicated as promising antigens, and are considered important targets in vaccine design against several flaviviruses. Our group constructed two recombinant plasmids encoding the E protein ectodomain (pZKEctoE) and the NS1 protein (pZKNS1) from ZIKV. The aim of this work was to investigate the ability of these plasmids to mediate the expression of recombinant proteins and to induce immune responses. BHK-21 cells were transfected with each plasmid and the expression of recombinant proteins was evaluated. As expected, the pZKectoE and pZKNS1 mediated expression of E and NS1 recombinant proteins, respectively. Activation of humoral and cellular immune responses in mice was evaluated by ELISA and by ELISPOT. The pZKectoE and pZKNS1 induced significant higher E- and NS1-specific antibody titers, respectively, than the control plasmid (pcTPA). Both plasmids were able to elicit T-cell responses with IFN-γ production upon stimulation with two libraries of E- and NS1-derived peptides. Mapping the immunogenic peptides through ELISPOT assays identified five immunodominant epitopes in E, and three in the NS1 protein. Most murine models for ZIKV studies use immunocompromised animals, which provides robust and lethal infections, but maybe they are not the ideal for vaccine tests. Therefore, in order to establish an immunocompetent murine model susceptible to ZIKV infection, we initiated experiments for neuroadaptation of a virus isolated from a patient in Brazil, by successive passages in the brain of newborn mice. Groups of newborn Swiss mice, ranging from three to nine days old, were infected by the intracerebral route with ZIKV. On the seventh day following infection, animals were euthanized and brains were collected. Samples were titrated by plaque assay in Vero cell cultures. At each passage, the sample with the highest viral titer was used for subsequent inoculation in the brain of other newborn mice. Our results showed an alteration in the plaque morphology produced by infection with virus isolated after the mouse passage comparing to those observed with the initial sample. Regarding viral load, there was a 4-log increase during the first four passages followed by a slight reduction. Sequencing of the virus genome revealed some point mutations and experiments will be continued by virus passages in older mice. Overall, the pZKEctoE and pZKNS1 vaccines were able to mediate expression of E or NS1 recombinant proteins with activation of humoral and cellular immune responses. So far, the establishment of an immunocompetent murine model has not been possible. To obtain neuroadapted virus capable of causing clinical signs of infection in adult animals, further passages in Swiss mouse brains should be performed
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