Evaluation of phenotypic profile, pharmacological aspects and mode-of-action of novel antiparasitic agents for neglected diseases

Abstract

A proposta de doutorado em cotutela está alinhada à necessidade atual e urgente de alternativas de tratamento para doenças tropicais negligenciadas (DTNs). As DTNs carecem de vacinas eficazes e tratamentos satisfatórios, apesar de sua alta incidência e taxas de mortalidade em comunidades pobres em áreas tropicais e subtropicais subdesenvolvidas, principalmente na África, América Latina e Ásia. Assim, tratamentos novos, mais eficazes, seguros e acessíveis são urgentemente necessários. Diferentes abordagens in silico, in vitro e in vivo foram empregadas na busca de novos candidatos a fármacos para doença de Chagas, doença do sono e leishmaniose cutânea (LC) causadas pelos tripanossomatídeos Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei ssp e Leishmania amazonensis, respectivamente. Primeiramente, os compostos foram avaliados in vitro e in vivo em modelos experimentais de LC causado por L. amazonensis, incluindo: (i) derivados de triagem virtual baseada em ligante (derivado de oxazolo [4,5-b] piridina (GNF5343)); (ii) pertencentes a uma série de fenilsulfonilacetamidas, acetatos e triterpenóides pentacíclicos inspirados em produtos naturais; (iii) agentes nitroaromáticos derivados de moldes de 4-nitrofenilacetil e 4-nitro-1H-imidazolil. Três dos 55 compostos foram ativos e seletivos in vitro (IC50 <10 μM, índice de seletividade ≥ 50) contra formas intracelulares de L. amazonensis presentes em macrófagos infectados: um sulfonil (Cp30) e dois nitro-derivados (Cp6 e 7). No entanto, quando animais infectados com L. amazonensis foram tratados por 14 dias por gavagem oral com 10 mg / kg duas vezes ao dia (bid), não houve redução do tamanho das lesões dos animais nem da carga parasitária avaliada por qPCR. Em sequência, os análogos de nucleosídeos (7-deazapurinas) foram (iv) triados in vitro e in vivo contra um painel de parasitas tripanossomatídeos (diferentes DTUs de T. cruzi e T. brucei spp), além de (v) avaliar a estabilidade metabólica in vitro (na presença de enzimas da superfamília CYP450 e uridina glucuronosil transferase). Além disso, o modo-de-ação (MoA) de alguns análogos de nucleosídeos foi explorado em nível molecular (métodos RNAi e CRISPR/Cas9 para T. brucei e T. cruzi, respectivamente). Dentre os principais achados, Dois análogos de nucleosídeos (FH11706 e FH10714) foram muito ativos sobre T. cruzi (IC50 0.20-0.05 μM), seletivos e metabolicamente estáveis in vitro, exibindo elevados índices de seletividade (IS> 300), justificando sua futura análise in vivo. Em relação à FH8512, o uso de um modelo murino de infecção aguda por T. cruzi sob um período prolongado de tratamento (até 60 dias de administração consecutivos) com 25 e 2.5 mg / kg bid, resultou na supressão da parasitemia e sobrevivência dos animais. No entanto, a terapia a longo prazo não evitou a reincidência do parasita evidenciada por qPCR. Estudos de MoA com uma biblioteca de interferência de RNA do genoma de T. brucei (RNAi) revelaram adenosina quinase (ADKIN), rac-serina quinase (RSKIN) e uma NADPH-oxidorredutase como alvos putativos dos análogos de nucleosídeos estudados. Em seguida, os genes ortólogos correspondentes foram escolhidos como ponto de partida para inferir o MoA na cepa Dm28 de T. cruzi usando uma abordagem de edição de gene CRISPR / Cas9. A inaptidão para a recuperação de duplo nocaute e fitness reduzido dos clones heterozigotos RSKIN +/- sugerem que os alvos testados em T. cruzi sejam genes essenciais. Estudos adicionais em maior grau de detalhamento estão em andamento para melhor caracterizar os clones de parasitas heterozigotos gerados