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Title: Avaliação da capacidade infectiva do vírus zika sobre hepatócitos e células estreladas hepáticas em estudos in vitro
Advisor: Oliveira, Sheila Andrade de
Members of the board: Oliveira, Sheila Andrade de
Vasconcelos, Luydson Richardson Silva
Costa, Vlaudia Maria Assis
Authors: Lucena, Jéssica Paula.
Coadvisor: Pena, Lindomar José
Moura, Danielle Maria Nascimento
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: As doenças hepáticas crônicas, de diversas etiologias, têm em comum a inflamação crônica hepatocelular que pode levar ao desenvolvimento da fibrose. Por se tratar de morbidades com prevalência mundial, as hepatopatias crônicas são doenças de base em pacientes acometidos pelas mais variadas patologias, a exemplo de casos descritos de infecção por flavivírus com acometimento hepático ocorridos durante epidemias. O vírus Zika é um flavivírus e apesar de ter sido descrito pela primeira vez em 1947, tornou-se um problema de saúde pública devido a sua implicação na síndrome congênita e de Guillain-Barré. A patogênese viral e possíveis efeitos sinérgicos em comorbidades precisam ser elucidados. O objetivo desse trabalho foi avaliar se o ZIKV é infecta hepatócitos e células estreladas hepáticas, alterando o processo de reparo hepático. Para tal, as linhagens celulares GRX, LX-2, HepG2 e Vero foram infectadas por ZIKV na multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1. Na curva de crescimento viral one step foram observados as 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após infecção. A produção da progênie viral foi determinada por titulação pelo método de TCID50 em células Vero. Também foi feita uma curva de viabilidade avaliando 24, 72 e 120 h após infecção, na qual foi observada perda de viabilidade severa nas linhagens HepG2 e LX-2. As GRX apresentaram 80% de sobrevivência após 120 h de infecção. A infecção foi confirmada através do Kit molecular ZDC. A citocina TGF-β1 foi quantificada pela técnica de ELISA em sobrenadante de cultura de células infectadas em diferentes intervalos, na qual foi observado aumento nas concentrações da citocina em todas as linhagens, com resposta mais expressiva nas células estreladas, cuja diferença já pôde ser observada a partir de 48 horas. Além disso, citocinas pró-inflamatórias foram quantificadas pela técnica de CBA e foi observada maior produção de IL-8 e IL-6 nas linhagens HepG2 e LX-2 após 2 e 4 dias de infecção, respectivamente. A citocina IL-6 não foi detectada na linhagem GRX, enquanto que IL-8 não demonstrou diferença entre infectada e controle. Na avaliação a nível ultraestrutural foi possível constatar alterações morfológicas, tais quais hipertrofia do retículo endoplasmático associado a vesículas contendo partículas virais e rearranjo dos microtúbulos, avaliados por microscopia eletrônica de transmissão. Além da presença de autofagossomos e corpos lamelares nas células infectadas. Os achados desse trabalho permitem concluir que o ZIKV é capaz de infectar as linhagens avaliadas, causar alterações celulares e levar à perda da viabilidade celular nas linhagens HepG2 e LX-2. A linhagem GRX mostrou-se permissiva à infecção e resistente ao estresse. A infecção viral foi capaz de influenciar o processo de fibrogênese, estimulando da produção de citocinas pró-fibrogênicas e pró-inflamatórias, sugerindo que esse vírus é capaz de descompensar patologias pré-estabelecidas.
Abstract: Chronic liver diseases are caused by several etiologies, which have in common hepatocellular inflammation and the development of liver fibrosisBecause they are morbidities with worldwide prevalence, chronic liver diseases are underlying diseases in patients with various clinical conditions. During the epidemics of arboviruses, cases of flavivirus infection with hepatic impairment were described. The Zika virus (ZIKV) belongs to the genus flavivirus, as does the Yellow Fever and Dengue virus. Although first described in 1947, it has become a major public health problem due to its association with microcephaly and Guillain-Barré Syndrome. Questions regarding pathogenesis and possible synergistic effects on comorbidities need to be clarified. The present project aims to evaluate whether ZIKV is infects hepatocytes and stellate liver cells and alters the liver repair process. For this, GRX, LX-2, HepG2 and Vero (as control) were cultured and infected by ZIKV at the multiplicity of infection (MOI) of 0,1. One-step viral growth curves were performed, at intervals of 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours after infection. The production of the viral progeny was determined by titration using the TCID50 method in Vero cells. Cell viability of 24, 72 and 120 hours post infection was assessed with the microplate XTT technique, read on a spectrophotometer, in which was observed severe viability loss in HepG2 and LX-2 cells, with 40% survival after 120 hours. GRX cells showed 80% survival after same period. The infection was confirmed using the ZDC Molecular Kit. TGF-β1 cytokine was quantified by ELISA technique in infected cells culture media in different intervals, in which was founded higher levels in all evaluated lineages, with a more expressive response in the hepatic stellate cells, with 48 hours post infection. Moreover, proinflammatory cytokines were quantified by CBA, in which was observed that HepG2 and LX-2 infected cells produced higher levels of IL-6 and IL-8, after 2- and 4-days post infection, respectively. IL-6 was not detected in GRX cells and IL-8 doesn’t have showed any difference between infected and control group. In ultrastrutural analysis, it was observed morphological changes, such as endoplasmatic reticulum hypertrophy associated to vesicular bodies containing viral particles, seen by transmission electron microscopy. Furthermore, the presence of autophagossomes and lamellar bodies was founded in infected cells. These findings allow us to conclude that ZIKV is able to infect the evaluated cell lineages, leading to morphological changes and viability loss in HepG2 and LX-2 cells. GRX cells have showed to be permissive to infection but resistant to stress. Moreover, we can conclude that ZIKV infection can affect the fibrogenesis process, through production stimuli of profibrogenic and proinflammatory cytokines, suggesting that ZIKV may cause disbalance pre-stablished pathologies in patients with liver diseases.
Keywords: Zika virus infection - virology
Zika virus - metabolism
Hepatocytes - virology
Stellate Liver Cells
True cells
Liver - virology
Hep G2 cells
Viral cytopathogenic effect
???metadata.dc.subject.fr???: Infection par le virus Zika - virologie
Virus Zika - métabolisme
Hépatocytes - virologie
Cellules étoilées du foie
Vraies cellules
Foie - virologie
Cellules Hep G2
Effet cytopathogène viral
keywords: Infecção pelo vírus Zika - virologia
Vírus Zika - metabolismo
Hepatócitos - virologia
Células Estreladas do Fígado
Células Vero
Fígado - virologia
Células Hep G2
Efeito Citopatogênico Viral
DeCS: Infecção por vírus Zikavirol
Vírus Zikametab
Hepatócitosvirol
Células estreladas do fígado
Células Vero
Fígado
Células Hep
Efeito cipatogênico viral
Issue Date: 2021
Citation: LUCENA, Jéssica Paula.. Avaliação da capacidade infectiva do vírus zika sobre hepatócitos e células estreladas hepáticas em estudos in vitro. 2021. 106 p. Dissertação, (mestrado)-Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2021.
Date of defense: 2021-04-28
Place of defense: Recife
Department: Instituto Aggeu Magalhães
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz
Program: Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia em Saúde
Embargo date: 2023-06-10
Copyright: closed access
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