Avaliação comparativa do perfil de expressão e de isoformas associadas a dois homólogos do fator de tradução eIF2γ de Leishmania infantum

Abstract

Os tripanosomatídeos são protozoários patogênicos dos gêneros Leishmania e Trypanosoma que possuem mecanismos moleculares únicos associados à sua expressão gênica. Acredita-se que a etapa de iniciação da tradução seja um dos principais alvos de regulação da expressão gênica nestes parasitas. O fator eIF2 é responsável por mediar a associação do GTP e do tRNA ligado a Metionina inicial (Met-tRNAi) com a subunidade menor ribossomal e é formado pelas subunidades α, β e γ, com o eIF2γ constituindo o núcleo do complexo. Em Leishmania, a descoberta de dois homólogos de eIF2γ (EIF2γ-1 e EIF2γ-2) ressalta a possibilidade de sua ação em eventos de regulação. Este trabalho teve início com análises de expressão usando soro policlonal dirigido a ambos os homólogos de eIF2γ de Leishmania que foi capaz de reconhecer os dois homólogos quando superexpressos de forma ectópica, entretanto apenas o EIF2γ-1 nativo foi reconhecido de forma clara e reprodutível. Em curvas de crescimento da forma promastigota de L. infantum, foram vistas duas isoformas para o EIF2γ-1 durante crescimento exponencial, com diminuição da isoforma de maior tamanho a partir de 120h. Em curva de crescimento amastigota, o EIF2γ-1 apresenta duas isoformas. Esse padrão se manteve inalterado em condições de estresse de temperatura, nutricional e oxidativo. Em nenhuma dessas condições se observou maior expressão do EIF2γ-2 nativo, cuja abundância foi tentativamente estimada, com níveis de 10 a 30 vezes menores do que os do EIF2γ-1. As isoformas observadas para o EIF2γ-1 sugere alterações por modificações pós-traducionais. Para investigar e mapear possíveis sítios alvos dessas alterações foram realizados ensaios de mutagênese sítio dirigida no gene codificante do EIF2γ-1 em motivos candidatos. Os genes mutantes foram clonados em vetor para expressão no parasita fusionado ao epítopo HA, seguido de transfecção em L. infantum. O impacto destas mutações foi avaliado e não afetaram o perfil de expressão das isoformas.