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AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL PRODUZIDA CONTRA A PROTEÍNA DO CIRCUNSPOROZOÍTO (CSP) DE PLASMODIUM FALCIPARUM ASSOCIADOS À ESPOROS DE BACILLUS SUBTILIS
Almeida, Maria Edilene Martins de | Date Issued:
2022
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Atualmente, ainda não existe vacina para malária com capacidade de gerar uma proteção com alta eficácia, sendo as formulações que contêm a proteína de superfície de circunsporozoíto (PfCSP) as mais avançadas nos estudos em humanos. Uma etapa importante no desenvolvimento de uma vacina, além da identificação do antígeno, é avaliar como este será apresentado, bem como o efeito imunoestimulatório dos componentes da formulação (imunoestimulantes). Os esporos de Bacillus subtilis têm sido avaliados há duas décadas como partículas vacinais adjuvantes, as quais promovem a elevação da resposta humoral após a coadministração com antígenos tanto acoplados ou integrados à sua superfície. Logo, somando as características imunoestimulantes, probióticas e de alta resistência dos esporos com a grande capacidade de estimular uma resposta humoral protetora da PfCSP, este trabalho buscou investigar em modelo murino a possível utilização deste método como uma nova formulação de adjuvante para uma vacina contra malária. Para tanto, duas abordagens de apresentação foram testadas: acoplando a PfCSP recombinante (rPfCSP, produzida em Escherichia coli) na superfície dos esporos e recombinando o B. subtilis de modo a expressar o antígeno na superfície de seus esporos. Com as ferramentas produzidas, camundongos Balb/c foram imunizados via intranasal, sendo a resposta imune humoral (IgG total e subclasses) acompanhada por ELISA indireto. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que a proteína rPfCSP foi produzida com êxito no sistema de expressão usando E. coli como hospedeiro, no qual estava presente porção solúvel do lisado bacteriano. As imunizações por via intranasal utilizando a rPfCSP acoplada aos esporos revelaram que estes podem estimular uma maior produção de anticorpos, mais rápida e por um período mais longo contra o antígeno rPfCSP quando comparada ao grupo estimulado apenas com a proteína recombinante. Além disso, foi observada uma resposta imune de perfil balanceado Th1/Th2 após análise do perfil de produção das subclasses. A recombinação da proteína PfCSP em B. subtilis foi obtida com sucesso, esta foi expressa na superfície dos esporos pelo endereçamento obtido com fusão à proteína C de revestimento do esporo( CotC), no qual não foram observadas clivagens do antígeno-alvo nos imunoensaios realizados, indicandoque esta não sofreu ação das proteases ainda presentes no hospedeiro utilizado. Os esporos de B. subtilis recombinados com PfCSP foram capazes de induzir uma resposta imune por via intranasal com níveis de IgG elevados que se mantiveram circulantes por 150 dias, apresentando um perfil de resposta imune predominante Th1. Este foi o primeiro estudo que buscou avaliar o potencial uso de esporos de B. subtilis como adjuvante de um antígeno candidato vacinal para malária. Os resultados promissores aqui obtidos podem reacender o interesse no potencial uso da via de mucosa, como forma não invasiva para obtenção de proteção contra a esta doença
Abstract
Currently, there is still no vaccine for malaria capable of generating highly effective protection, and the formulations containing the circumsporozoite surface protein (PfCSP) are the most advanced in human studies. An important step in the development of a vaccine, in addition to identifying the antigen, is to evaluate how the antigen will be presented, as well as the immunostimulatory effect of the components from this formulation (immunostimulants). Bacillus subtilis spores have been evaluated for two decades asadjuvant vaccine particles, which promote an increase in the humoral response after co-administration withantigens either coupled or integrated to its surface. Therefore, adding the immunostimulant, probiotic and high-resistance characteristics of the spores with the great capacity to stimulate a protective humoral response of PfCSP, this work sought to investigate in a murine model the possible use of this method as anew adjuvant formulation for a vaccine against malaria. Therefore, two presentation approaches were tested: coupling recombinant PfCSP (rPfCSP, produced in Escherichia coli) on the surface of the spores, and recombining B. subtilis to express the antigen on the surface of its spores. With these tools produced,Balb/c mice were immunized intranasally, and the humoral immune response (total IgG and subclasses) was accompanied by indirect ELISA. The results obtained in this work demonstrated that the rPfCSP protein was successfully produced in the expression system using E. coli host, being purified in the soluble portionof the bacterial lysate. Intranasal immunizations using rPfCSP coupled to spores revealed that they can stimulate anti-rPfCSP antibody’s production greater, faster and for a longer period when compared to the group stimulated only with the recombinant protein. Furthermore, an immune response with a balanced Th1/Th2 profile was observed after analyzing the subclass production profile. Recombination of B. subtiliswith PfCSP was successfully obtained, being expressed on the surface of the spores through theaddressing obtained by the fusion with the CotC protein. Any cleavage was observed in the immunoassaysperformed, indicating that it was not affected by the proteases from B. subtilis. Recombined spores were able to induce an immune response intranasally with high levels of IgG that remained circulating for 150 days, showing a predominantly Th1 immune response profile. This was the first study that sought to assessthe potential use of B. subtilis spores as an adjuvant to a malaria vaccine antigen candidate. The promisingresults obtained here may rekindle interest in the potential use of this pathway as a non-invasive way to obtain protection against this disease
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