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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/57783
Type
DissertationCopyright
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Sustainable Development Goals
03 Saúde e Bem-EstarCollections
Metadata
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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO IN VITRO DE VACINAS DE DNA CONTRA O VÍRUS ZIKA
Imunogenicidade
Expressão das proteínas prM/M-E in vitro
Adjuvantes Moleculares
inmunogenicidad
Expresión de proteínas prM/M-E in vitro
Adyuvantes Moleculares
Leite, Bruno Henrique de Sousa | Date Issued:
2022
Advisor
Co-advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract in Portuguese
O vírus Zika (ZIKV) é um flavivírus emergente que tem sido associado a distúrbios neurológicos como a Síndrome de Zika Congênita e a síndrome de Guillain Barré. Diante deste quadro, o desenvolvimento de estratégias vacinais capazes de conter a disseminação viral é uma prioridade de saúde pública. Sabe-se que as proteínas de superfície do vírus (Envelope – E e Pré - Membrana/Membrana – prM/M) são as mais antigênicas e indicadas como melhores candidatas à imunização. Desta forma, o nosso grupo de pesquisa desenhou formulações vacinais de DNA contra o ZIKV, a qual apresenta os antígenos vacinais de prM/M-E associados a adjuvantes moleculares visando potencializar as respostas celulares e humorais. As regiões do vírus relacionadas ao ancoramento à membrana celular foram retiradas das sequências finais contidas no plasmídeo. Portanto, nós hipotetizamos que formulações vacinais de DNA associadas a adjuvantes moleculares promovem aumento da expressão dos antígenos do vírus Zika in vitro, conferindo assim, umac maior imunogenicidade da vacina. Os resultados da primeira construção vacinal desenvolvida, p43.2 ZIKV/-C-prM/M-E-LAMP, mostraram que esta vacina expressa os antígenos virais em baixas concentrações quando avaliadas por imunofluorescência em células de mamíferos. Partindo disso, foram desenvolvidas novas formulações vacinais, inseridas no vetor de expressão pcDNA3.1, com substituições do peptídeo sinal da proteína nativa (C- terminal do Capsídeo de ZIKV) pelo peptídeo sinal da proteína do ativador de plasminogênio tecidual (SP-tPA), adição da sequência consenso Kozak, deleção da região Stem (Haste, tradução do inglês) e Transmembrana (TM), e adição ou remoção da proteína LAMP, denominadas neste trabalho como segunda formulações vacinas de DNA. Estas vacinas, foram avaliadas em células de camundongo, BHK-21, quanto aos níveis de expressão das proteínas prM/M-E por ELISA baseado em células e o tráfego celular destes antígenos foram observados por imunofluorescência, com auxílio do microscópio Leica DMi8. Desta forma, foi observado que adjuvantes moleculares inseridos nas sequências vacinais, são essenciais para obter melhores níveis de expressão de proteínas e como melhor candidata, a vacina pCDNA3.1 ZIKVEΔSTEM obteve os melhores resultados quanto à expressão das proteínas virais de ZIKV. Além disso, esta vacina prosseguiu para testes pré-clínicos (in vivo, em camundongos), em colaboração com o grupo da Drª Maria Sato (USP), a fim de validar os efeitos protetores desta formulação.
Abstract
Zika virus (ZIKV) is an emerging flavivirus that has been associated with neurological disorders such as Congenital Zika Syndrome and Guillain Barré syndrome. Given this picture, the development of vaccine strategies capable of containing viral spread is a public health priority. It is known that the surface proteins of the virus (Envelope - E and Pre - Membrane/Membrane - prM/M) are the most antigenic and indicated as best candidates for immunization. Thus, our research group has designed DNA vaccine formulations against ZIKV, which present the prM/M-E vaccine antigens associated with molecular adjuvants aiming to potentiate cellular and humoral responses. The virus regions related to anchorage to the cell membrane were taken from the final sequences contained in the plasmid. Therefore, we hypothesized that DNA vaccine formulations associated with molecular adjuvants promote increased expression of Zika virus antigens in vitro, thus conferring enhanced immunogenicity of the vaccine. The results of the first vaccine construct developed, p43.2 ZIKV/-C-prM/M-E-LAMP, showed that this vaccine expresses the viral antigens at low concentrations when evaluated by immunofluorescence in mammalian cells. Based on this, new vaccine formulations were developed, inserted into the expression vector pcDNA3. 1 expression vector, with substitutions of the native protein signal peptide (C-terminal of ZIKV capsid) for the signal peptide of tissue plasminogen activator protein (SP-tPA), addition of the Kozak consensus sequence, deletion of the Stem and Transmembrane (TM) regions, and addition or removal of the LAMP protein, denominated in this work as second DNA vaccine formulations. These vaccines were evaluated in mouse BHK-21 cells for the expression levels of prM/M-E proteins by cell-based ELISA, and the cellular traffic of these antigens was observed by immunofluorescence with the aid of a Leica DMi8 microscope. Thus, it was observed that molecular adjuvants inserted into the vaccine sequences, are essential to obtain better levels of protein expression and as the best candidate, the pCDNA3.1 ZIKVEΔSTEM vaccine obtained the best results regarding the expression of ZIKV viral proteins. In addition, this vaccine proceeded to preclinical testing (in vivo, in mice), in collaboration with Dr. Maria Sato's group (USP), in order to validate the protective effects of this formulation.
Keywords in Portuguese
Vacina de DNAImunogenicidade
Expressão das proteínas prM/M-E in vitro
Adjuvantes Moleculares
Keywords in Spanish
vacuna de ADNinmunogenicidad
Expresión de proteínas prM/M-E in vitro
Adyuvantes Moleculares
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