Obtenção e caracterização de aptâmeros contra antígenos e anticorpos do vírus zika

Abstract

O vírus zika (ZIKV) tornou-se um grande problema de saúde pública no início de 2015, quando casos de síndrome de Guillain-Barré e microcefalia foram associados à infecção viral. Atualmente, o ZIKV é endêmico em todas as áreas tropicais do mundo, e a chance de futuras epidemias permanece real, sendo crucial a utilização de testes laboratoriais precisos. O objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar aptâmeros de DNA fita simples específicos para o ZIKV, para a proteína NS1 do ZIKV e para anticorpos contra a proteína NS1 do ZIKV (anti-NS1z), a fim de utilizá-los em diagnósticos para zika, sem reatividade cruzada com outros flavivírus. Para obter aptâmeros para partícula viral, o ZIKV foi cultivado em células Vero e usado como alvo da seleção. Na seleção dos aptâmeros para NS1z, utilizamos proteínas produzidas em E. Coli (não-glicosilada) e em células de inseto (glicosilada). Os aptâmeros para o anticorpo foram selecionados a partir de um mAb anti-NS1z produzido em Bio Manguinhos. Seleções negativas foram adicionadas às seleções do ZIKV e da NS1z. A seleção dos aptâmeros foi realizada utilizando a metodologia SELEX, onde foram escolhidas quatro sequências de aptâmeros para a partícula viral íntegra; três sequências para a proteína NS1 glicosilada (rNS1zg); duas para a proteína NS1 não glicosilada (rNS1z); e sete para o mAb anti-NS1. Para a predição das estruturas secundárias e terciárias dos aptâmeros, foram utilizados os programas UNAFold, RNAComposer e Chimera, que possibilitaram a seleção de aptâmeros com menor energia livre. No encaixe molecular aptâmero-alvo, realizado pelo HDOCK, foi possível identificar modelos com maior potencial de utilização em testes de diagnóstico. A interação dos aptâmeros foi avaliada por ELISA e suas constantes de dissociação (Kd) foram calculadas por espectroscopia de fluorescência e/ou termoforese em microescala (MST) e/ou calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os ELISAs em placas tratadas com polilisina demonstraram que todos os aptâmeros selecionados foram capazes de reconhecer seus alvos. Nos ELISAs utilizando aptâmeros amino modificados em placas com anidrido maleico, os tampões de bloqueio testados não funcionaram efetivamente, invalidando os testes. A afinidade e a especificidade dos aptâmeros para as partículas do ZIKV foram confirmadas pela MST, demonstrando a ligação dos aptâmeros tanto na partícula viral como na proteína NS1z e não apresentando reatividade com os sorotipos do vírus dengue (DENV). O aptâmero rNS1z_19 demonstrou ser o mais promissor para a proteína NS1z não glicosilada, tanto por espectroscopia de fluorescência como por nano-ITC. Os experimentos de MST e nano-ITC envolvendo aptâmeros para a proteína NS1 e para o mAb precisam ser executados em maiores concentrações. Os aptâmeros ZIK01 e ZIK02, selecionados para a partícula de ZIKV, foram os mais promissores para utilização em ensaios de diagnóstico diferencial entre infecções causada por ZIKV e DENV