Caracterização funcional dos polimorfismos detectados no vírus da febre amarela durante o surto no Brasil em 2017

Abstract

A febre amarela é uma arbovirose com altas taxas de mortalidade, que ocasiona surtos esporádicos na África e na América do Sul. O vírus da febre amarela (Yellow fever virus – YFV) responsável pela disseminação da doença no Brasil desde a virada do século, pertence a uma sub-linhagem moderna do genótipo sul-americano I, a sub linhagem 1E. A partir de 2015, foi detectado um conjunto de nove marcadores genéticos no YFV, que ocasionou em 2017 e 2018 um surto sem precedentes, desde o início da vacinação. Esses marcadores representam uma assinatura molecular inédita, considerando todas as sequências do vírus disponíveis em domínio público. Das nove substituições, oito estão localizadas nas proteínas NS3 e NS5. A localização por modelagem tridimensional de NS3 e NS5 sugeriu que tais alterações poderiam influenciar nas funcionalidades destas proteínas, e talvez, desempenhar algum papel de adaptação aos hospedeiros. Este trabalho propõe estudar o efeito das alterações genéticas nas proteínas NS3 e NS5 em diferentes aspectos biológicos do ciclo replicativo viral: na infecção viral em culturas celulares e em camundongos; na modulação da resposta antiviral por interferon do tipo I (IFN-I); e na atividade enzimática do domínio MTase da proteína NS5. Em uma primeira análise, avaliou-se o papel na infecção viral de quatro vírus isolados de primatas não humanos, dois carreando a assinatura molecular. Estes vírus foram comparados quanto à capacidade de infectar células de mosquitos e de mamíferos, e quanto à neurovirulência em camundongos. Observamos que os fenótipos apresentados pelos vírus isolados eram resultado de múltiplos fatores genéticos adicionais, e não estavam relacionados à assinatura molecular, permitindo a identificação de potenciais marcadores de virulência. Em uma segunda abordagem, foram sintetizados cinco YFV a partir do isolado selvagem ES-504 de 2017, com diferentes composições genéticas em relação aos marcadores nas proteínas NS3 e NS5. A administração viral intracerebral em camundongos evidenciou que animais inoculados com os vírus sintéticos não apresentaram diferenças em relação aos indicadores de neurovirulência, enquanto os animais inoculados com os isolados virais divergiram neste parâmetro. Os YFV sintéticos ainda foram avaliados quanto à infectividade em camundongos susceptíveis AG129, e os resultados mostraram que os marcadores na proteína NS3 não ocasionaram diferenças em infectividade, enquanto os marcadores da assinatura molecular na proteína NS5 resultaram em atenuação viral. Portanto, os resultados obtidos indicam que os marcadores presentes na proteína NS5 podem ser os principais envolvidos na modulação de virulência viral. A caracterização da atividade enzimática da proteína NS5 MTase foi avaliada comparando a proteína NS5 do surto 2017-2019 com uma variante enzimática de YFV circulante nos anos 2000s. A cinética enzimática e os ensaios de inibição sugerem que a proteína do YFV 2017-2019 tem afinidade menor pelo doador de metila que a proteína presente nos vírus do recente surto, indicando que estas alterações podem interferir na conformação do sítio de ligação a este substrato. Porém, o impacto estrutural das substituições não influenciou na replicação viral em modelo celular, nem na neurovirulência em camundongos. Por fim, os resultados em modelo celular de resistência à tratamento com IFN- I mostraram que os marcadores no domínio MTase influenciam no aumento da sensibilidade a resposta imune mediada por esta citocina. Os resultados obtidos neste projeto sugerem que a assinatura molecular do YFV 2016-2019 nas proteínas NS3 e NS5 representam marcadores do YFV que modulam replicação e virulência em modelo celular e murino. Estes resultados contribuíram para o melhor entendimento das bases biológicas da infecção viral e patogênese do YFV circulante no Brasil desde 2015.